原位杂交反应实验流程与注意事项

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rna原位杂交钟鼎生物技术支持

  本文介绍了rna原位杂交中的杂交这一步的流程,包括试剂配制、注意事项以及三天原位杂交的详细操作步骤,供大家参考。

1.原位杂交试剂配制:

①. 1 M Tris-HCI (pH7.5) 500ml
  Tris base 60.55g,浓盐酸约32ml。加浓盐酸调PH至7.5,定容至500ml.
②. 1 M Tris-HCI (pH 9.5) 300ml
  Tris base 36.33g,浓盐酸1ml。加浓盐酸调pH至9.5,定容至300ml.
③. 0.5M EDTA-2Na pH 8.0 500ml
  EDTA-2Na 93.06g,NaOH约10g,完全溶解后,调pH至8.0,定容于 500ml.
④. 2mg/ml Glycine 500ml
⑤. 1M MgCl2 100ml
  MgCl2.6H2O 20.331g,定容至 l〇〇ml.
⑥. 5M NaCl 500ml
  NaCl 146.1g,定容至 500ml。
⑦.20×SSPE pH 7.4 1L
  NaCl 175.3g,NaH2PO4 24g,0.5M EDTA(pH 8.0)40ml,定容至1L。
⑧.10×PBS pH 7.4 500ml   NaCl 38g,NaH2PO4 1.8g,Na2HPO4 4.95g,定容至500ml。
⑨:50%硫酸葡聚糖(Detran sulfate)
  Detran sulfate 5g,定容至10ml。分装至1.5ml离心管中,保存于-20℃
该溶液比较粘稠,我们建议配好后直接按照需要的量1ml分装到10ml的离心管中,放在4度,用的时候直接往离心管中加其他成分。供参考
⑩.10mg/ml yeast t-RNA 25mg yeat t-RNA(invitrogen),溶于2.5ml DEPC·H2O中.

注意事项:所有试剂都要用灭菌的DEPC·H2O配,配试剂用到的量筒需要180℃烘6hrs,a-i在配好后需要灭菌。用时都要在超净台上打开,以免长菌。

2.杂交前的准备:

脱蜡缸、镊子、剪刀等要180℃烘6hrs,切片要37-42℃烘1-2天。10×Blocking solution(3)从-20℃冰箱拿出解冻

原位杂交第一天

3.脱蜡和复水,通风橱中进行:

脱蜡和复水
二甲苯 20min
二甲苯 20min
二甲苯+无水乙醇 2min
无水乙醇 2min
无水乙醇 2min
95%乙醇 2min
85%乙醇 2min
70%乙醇 2min
50%乙醇 2min
30%乙醇 2min
15%乙醇 2min
DEPC·H2O 2min
DEPC·H2O 2min

在脱蜡的同时配制并预热Proteinase K buffer.

Proteinase K buffer(100ml):
1M Tris-HCl(pH7.5) 10ml
0.5M EDTA-2Na(pH8.0) 10ml
DEPC·H2O 80ml

37℃温箱中预热。

4.Proteinase K处理:

  Proteinase K稀释到1μg/ml,37℃处理40min。PBS洗一次,2mg/ml Glycine浸泡2min,再次用PBS洗一次。   

  

5.脱水,用刚才的溶液:

  
脱水
DEPC·H2O 2min
DEPC·H2O 2min
15%乙醇 2min
30%乙醇 2min
50%乙醇 2min
70%乙醇 2min
85%乙醇 2min
95%乙醇 2min
无水乙醇 2min

超净台上吹干,约30-50min。

6.预杂交:

先配制10×Hybridization salts,可4℃保存.

10×Hybridization salts(10ml):
1M Tris-HCl(pH7.5) 1ml
0.5M EDTA-2Na(pH8.0) 200μl
5M Nacl 6ml
DEPC·H2O 2.8ml
Prehybridization solution(10ml):
DEPC·H2O 1.85ml
去离子甲酰胺 5ml
10×Hybridization salts 1ml
50%硫酸葡聚糖 1ml
10×Blocking solution(3) 1ml
10mg/ml yeast t-RNA 150μl

  吸50%硫酸葡聚糖需要剪去枪头,配制过程尽量不要产生气泡,有气泡需要离心消泡。预杂交液可以-20℃保存。

  预杂交时,取150μl预杂交液滴加在吹干的载玻片上,并用大小合适的干净parafilm覆盖,不能产生气泡。将载玻片转移至离心管盒子中,盒中加DEPC·H2O,盖严以保湿。42°C预杂交1-3hrs。

7.杂交:

在预杂交液中加入探针,使其浓度为400-1000ng/mL。取下载玻片上的 parafilm,并在面巾纸上吸干,将稀释好的探针滴加150μl于载玻片上,用parafilm 覆盖,放入湿盒中。42°C杂交16-20hrs。

原位杂交第二天,不再需要用DEPC·H2O配制试剂。

8. 2×SSPE洗三次:
  第一次,揭开parafilm,将玻片浸入2×SSPE中。第二次、第三次,42℃ 15min。

9. 0.2×SSPE洗两次:
  57℃杂交炉中,最小转速,30min,两次。

10. 1×Blocking buffer洗,室温摇床,最小转速,30min.
  1×Blocking buffer(40ml,现配现用)

11. 免疫反应
  配制 BSA washing buffer(200ml,现配现用)
  先将Anti-Digoxigenin-AP 离心 12000rpm 5min,取上清,稀释在BSA washing buffer中,稀释比为1:2500-1:5000,室温杂交2hrs,最小转速摇晃。

12. 洗抗体:
   BSA washing buffer洗三次,每次15min,最小转速摇晃。
   在此期间配制TNM-50 buffer(120ml)

13.TNM-50 buffer洗三次,每次5min。

14.显色反应:
避光配制显色液,30ml TNM-50 buffer中加入0.3-0.8ml NBT/BCIP stock solution,依照具体显色情况,避光显色过夜。

原位杂交第三天

15.待到实验组明显显色而阴性对照没有显色时,将载玻片转移至双蒸水中,洗三次,每次2min。

16.脱水,用原位杂交第一天的溶液:

  因为显出的颜色溶于乙醇,所以脱水的过程要比较快,特别是当显出的颜色比较浅的时候,每一级不要超过10sec.

17.封片,37℃烘干.

18.拍照观察.

以上便是RNA原位杂交中三天杂交的详细操作流程,希望能抛砖引玉,如果你有什么想法欢迎来与我们交流。