大肠杆菌表达系统特点

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大肠杆菌表达系统的特点

大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌,目前为止,大肠杆菌在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。大肠杆菌增殖时间较短的,因此使大肠杆菌表达系统成为一种快捷的方式。通常重组基因在大肠杆菌中的表达只需要不到1 周的时间。同时,大肠杆菌系统还具有价格低廉的优势——大肠杆菌的培养基。

包涵体

  在大肠杆菌中,重组蛋白通常定位于胞质中,也可以定位于周质,在少数情况下会分泌到胞外。定位于胞质的蛋白质的表达效率是最高的,产量通常可以占总生物质的30%。然而,重组蛋白过高的表达可能会导致不溶性蛋白聚集体的累积,从而形成包涵体。

  不只是真核生物来源的蛋白质会形成包涵体,少数情况下,大肠杆菌之类的过表达原核生物来源的蛋白质也会形成包涵体。在大肠杆菌中,蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中几乎高10倍,这可能是真核蛋白质形成包涵体的原因。在某些情况下,包涵体大大妨碍了获得可溶的活性蛋白质。

  包涵体也有一定的好处,通常包涵体不易被蛋白酶降解,易于离心浓缩,很少被其他蛋白质污染,通过一定的手段,也能将包涵体再折叠成有活性的可溶性蛋白质。

温度和分子伴侣——减少包涵体的形成

  在蛋白质表达时降低温度至15-30°C,可使重组蛋白尽可能多地形成可溶的正确折叠的蛋白质,而尽可能少地形成包涵体。部分推测显示,降低温度会降低蛋白质转录、翻译和折叠的速率,从而使蛋白质能够正确折叠。同时,低温还会降低热休克蛋白酶的活性。

  另外,一些研究者通过在胞质中与重组蛋白共表达分子伴侣来促进蛋白质的可溶性。利用分子伴侣的方法运用可能具有蛋白质特异性,因此需要针对每种目标重组蛋白分别进行实验。

融合标签——提高重组蛋白可溶性

  提高许多重组蛋白可溶性的另一种方法是在重组蛋白的N端或C端融合可溶性的融合标签。已经证明能够提高重组蛋白可溶性的融合标签包括谷胱甘肽S转移酶如硫氧还蛋白、麦 芽 糖 结 合 蛋 白(maltose-binding protein,MBP )、小分子泛素样修饰蛋白及 NusA标签(JV-utilization substrate)。其中 GST标签和MBP标签还有另外的好处, 可以用做亲和纯化的标签。然而令人遗憾的是没有哪一种标签能够适用于所有的重组蛋白,必须对多种融合标签的促可溶表达能力进行评估。

  有多种策略可用于移除重组蛋白的融合标签,通常的做法有在融合标签和重组蛋白之间插入蛋白酶酶切位点,然后使用特异性的蛋白酶将其切除。但是,有时候,移除标签后重组蛋白可能会变得不可溶,所以必须对这一方法进行谨慎的测试。

二硫键的形成

  对于胞质表达,大肠杆菌通常不能促使重组蛋白二硫键的正确形成;由于二硫键氧化还原酶系统催化作用的存在,周质通常是大肠杆菌中唯一可形成二硫键的场所。

  因此,如果重组蛋白需要形成二硫键,就需要利用一个可切割的信号肽(如 pelB)将其定位于周质。然而 ,周质表达的一个主要不利之处在于蛋白质的表达量会大大降低。硫氧还蛋白和谷氧还蛋白能够促进胞质内半腕氣酸的还原反应,通过对大肠杆菌基因组的改造以破坏D sb系统的硫氧还蛋白还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基,就可以在胞质内创造更加适于二硫键形成的环境。这些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen公司实现了商业化。如果需要形成更多的二硫键,可以将重组蛋白与硫氧还蛋白融合后在trxB-/gor大肠杆菌菌株中进行表达。

翻译后修饰

大肠杆菌对蛋白质的进行翻译后修饰的能力有限,大肠杆菌不支持酶介导的N-连接的糖基化、轻基化、硫酸化、酰胺化等。

另外:
对于一个给定的表达系统能否高水平表达蛋白质并获得高质量的产品,这在很大程度上取决于该蛋白质。在选择表达方法时,必须认真地评估重组蛋白的特性及下游的应用。很多时候,表达方法的选择并不是显而易见的,此时必须对数种表达宿主进行评估。