蛋白质的特性

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在选择表达系统前,需要通过文献调研来确认重组蛋白之前是否已被表达过,并对公开出版的表达策略做出评估;同时,考虑清楚文献中重组蛋白的应用目的与你的预期应用是否相似或相容是很重要的。没有相应文献时,可参考表达或详细介绍同源蛋白的报道。

蛋白质的表达数量与多种基因组序列的测定、高通量表达方法的发展以及大规模的蛋白质结构计划有着密切的关系。

蛋白质的特性:大肠杆菌与密码子用法

  —般来说,在重组蛋白表达宿主的选择中,对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达,而不是真核表达系统,因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的,甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了,因为有大量的实例表明,真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达。当使用原核系统表达真核蛋白时 ,一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样,大肠杆菌对密码子的使用有偏性,其tRNA丰度反映了这一偏性。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 tRNA丰度的限制而效率不高。 tRNA短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于N端时尤其明显。不过,通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子tRNA丰度增加的商业化工程菌株(如Rosetta菌株,EMD——Novagen)可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。

蛋白质的特性:胞质蛋白

  对于胞质蛋白来说,选择最佳的表达系统取决于蛋白质的大小和分子内二硫键的数目。对于分子质量为10〜50 kD a 并含有极少二硫键的蛋白质而言,大肠杆菌是实现蛋白质可溶性表达的很好选择。对于更大或具有许多二硫键的蛋白质来说,如果需要可溶性表达,那么通常应优先选择杆状病毒或酵母表达系统。对于10kDa以下,有极少甚至没有二硫键的蛋白质,已通过融合可溶性标签,在大肠杆菌中实现了成功表达。或者,也可以将这些小蛋白质在毕赤酵母中进行分泌表达。然而,在这一途径中,必须小心监测,因为正常情况下存在于胞内的蛋白质被强制进入分泌途径时可能出现无意产生的糖基化。这可以通过检查序列确认其不含一致的N-连接糖基化位点来实现。遗憾的是,对于〇-连接糖基化,没有保守序列,所以必须对分泌的重组蛋白进行分析以确保其不含〇-连接聚糖。

蛋白质的特性: 分泌蛋白

  所有的表达宿主都可用于生产分泌蛋白。不过,正如之前所述,大肠杆菌缺少大部分发现于真核生物中的翻译后修饰功能。因此,大肠杆菌可能不适于表达分泌的真核蛋白,不过这也在很大程度上取决于下游的应用。

蛋白质的特性: 膜蛋白

  对于蛋白质的大量表达来说,膜蛋白极具挑战性。在某些情况下,只表达可溶的、亲水的部分就足够了,此时可以移除跨膜结构域,表达可溶部分。对于完整膜蛋白的表达,如何选择最佳的表达系统还没有明确的指导原则。不过,对于大部分真核膜蛋白,由于在折叠和翻译后修饰能力上的限制,大肠杆菌表达系统通常不是一个很好的选择。相对的,研究者已报道利用杆状病毒和酵母表达系统在一定程度上成功地实现了G蛋白偶联受体的表达。

蛋白质的特性: 毒性蛋白

  对表达宿主有毒的重组蛋白会给表达带来挑战, 不过这通常是可以克服的。如果重组蛋白有毒性,确定其毒性是否具有宿主细胞特异性通常是有用的。如果是的话,那么可以选择在一个相容性更好的表达宿主中进行表达。另一个选择是使用严格调控的、可诱导的表达系统,如在大肠杆菌和毕赤酵母中应用的那些表达系统。例如,已经开发了数个精确调控的可诱导大肠杆菌表达系统。在这些系统中,重组基因的表达由可诱导启动子、转录终止子、质粒拷贝数的控制或重组基因编码序列的修饰来调控。在可用的毕赤酵母系统中,AOXl启动子受诱导机制以及阻遏/去阻遏方法的联合严格调控。另外,有数项研究表明杆状病毒/昆虫表达系统可用于表达毒性蛋白。最后,对于哺乳动物表达系统来说,最简单的选择是瞬转表达。CHO细胞中的数种可诱导表达系统都需要花费相当多的时间以完成必要的细胞工程改造,而且利用这些表达系统很难获得严格调控的基因表达 ,而这种严格调控对于防止细胞死亡来说是必需的。