酶的反应条件通用指南与核酸修饰酶的应用

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  酶作为催化DNA分子特异性反应的一种工具在分子生物学实验中发挥着举足轻重的作用,本文描述了用于操纵DNA分子的酶类的性质和反应条件以及应用,这些酶包括:DNA和RNA聚合酶、核酸酶、磷酸酶和激酶等。

酶

  下面这两张表提供了酶反应条件的总的准则和简述了一些核酸修饰酶的应用,某些反应可以使用不止一种酶。由于不同的情况需要的反应参数不一致,应根据实际情况来分析。

酶反应条件的通用指南
反应体积/μl DNA量/μg 酶量/U 每种dNTP/(mmol/L) 反应温度/℃ 时间/min 备注
DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶 50 1 10 100NAD 10-25 2-16h
T4噬菌体DNA连接酶 50 1 1 500ATP 12-30 1-16h
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 25 1 3 20 20-37 15-30
T4噬菌体DNA聚合酶 50 2 5 100 11 20
T7噬菌体DNA聚合酶 50 2 5 300 37 20
经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 50 2 10 300 37 20
Taq DNA聚合酶 100 0.1-1 2.5 200 94,55,72 1-2 ①,②
外切核酸酶
外切核酸酶VII 50 2 10 37 1-30
外切核酸酶III 50 1 0.2 37 30
λ外切核酸酶 50 2 10 37 1-30
T7噬菌体基因6外切核酸酶 50 2 5 37 1-30
激酶
T4噬菌体多核苷酸激酶
5'标记(正向反应) 30 1-50pmol 20 50 37 60
寡核苷酸 30 1-10 20 1000ATP 37 60
5'标记(交换反应) 30 1-50pmol 20 60 37 60 ①,③
核酸酶
Bal 31核酸酶 50 2 10 30 1-30
脱氧核糖核苷酸(DNA酶I) 100 2 1 37 1-30
绿豆核苷酸 100 1 15 37 30
S1核苷酸 100 2 10 37 30
磷酸酶
BAP 50 1-20pmol 0.1 60 30
CIP 50 1-20pmol 0.1 37 30
RNA修饰酶
大肠杆菌RNA聚合酶 50 2 10 300NTP 37 30
SP6、T7、T3噬菌体RNA聚合酶 50 2 10 400NTP 37 30
poly(A)聚合酶 50 12.5RNA 5 250NTP 37 30
逆转录酶 50 1mRNA 40 40 37 30
RNA酶H 100 2RNA:DNA 1 37 20
T4噬菌体RNA连接酶 50 2 1 2000ATP 17 10h
末端转移酶 50 4 10 20 37 30

注意:很多反应参数如反应体积、dNTP浓度、反应时间和温度依具体的反应不同,将相应的10×或5×缓冲液稀释成1×,并按表中所述建立起个反应体系。除非本表“备注”栏内另有注明,反应的终止是在75℃温育10min,或加入2μl 0.5mol/L EDTA。

①:如下述提示终止反应DNA酶I:5 μl 0.5 mol/L EDTA;大肠杆菌DNA聚合酶I:75℃ 10min或1 μl 0.5 mol/L EDTA;Taq DNA聚合酶:置于-20℃;外切核酸酶VII:酚抽提和乙醇沉淀;Bal 31 核酸酶:75℃ 10min或5 μl 0.5mol/L EDTA; S1核酸酶、绿豆核酸酶和RNA酶H:1μl 0.5mol/L EDTA;BAP:加SDS至0.1%、蛋白酶K至100μg/ml,37℃温育30min,然后酚抽提2次,乙醇沉淀;CIP:75℃ 10min或酚抽提后乙醇沉淀;T4噬菌体RNA连接酶:2 μl 0.5 mol/L EDTA
②:DNA为模板(基因组),加入寡核苷酸引物各0.2-1μmol/L
③:加5 mmol/L ADP并以咪唑代替Tris
④:对SP6加1 mmol/L亚精胺
⑤:加100μCi[α-32P]dNTP,比活>400Ci/mmol,1μg oligo(dT)12-18

核酸修饰酶类的应用:

核酸修饰酶类的应用
应用
产生平端
除去3'突出端 T4或T7噬菌体DNA聚合酶
补平3'凹进端 T4或T7噬菌体DNA聚合酶,Klenow酶
cDNA合成
从RNA出发 逆转录酶
第二链 Klenow酶
克隆DNA片段 CIP;T4噬菌体连接酶;Klenow酶;限制性内切核酸酶
降解DNA
5'-3' T7噬菌体基因6和λ噬菌体外切核酸酶
3'-5' 外切核酸酶III
5'-3'和3'-5' Bal 31核酸酶
外切核酸酶,单链(3'和5') 外切核酸酶VII
内切核酸酶,双链
非特异性 DNA酶I和微球菌核酸酶
特异性 限制性内切核酸酶
内切核酸酶,单链 S1、Bal31和绿豆核酸酶
降解RNA 核糖核酸酶A和T1;微球菌核酸酶
降解DNA双链中的RNA 核糖核酸酶H
双链体 BAP和CIP
DNA测序 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶;Taq DNA聚合酶;Klenow酶;T4多核苷酸激酶;逆转录酶
内含子定位作图 外切核酸酶VII;S1核酸酶
DNA5'端标记 T4噬菌体多核苷酸激酶
DNA3'端标记 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶;Klenow酶;逆转录酶;末端转移酶
RNA3'端标记 poly(A)聚合酶;T4噬菌体RNA聚合酶
DNA的连接 大肠杆菌和T4噬菌体DNA连接酶
RNA的连接 T4噬菌体RNA连接酶
mRNA5'端定位作图 S1或绿豆核酸酶;逆转录酶;核糖核酸酶A
DNA甲基化 甲基化酶
构建嵌套式缺失体 Bal 31核酸酶或外切核酸酶III+S1或绿豆核酸酶
切口平移 DNA酶I,大肠杆菌DNA聚合酶I
寡核苷酸延伸 T7噬菌体DNA聚合酶;Klenow酶
磷酸化 T4多核苷酸激酶
RNA的poly(A)加尾 poly(A)聚合酶
聚合酶链式反应(PCR) Taq DNA聚合酶
引物指导的合成 Klenow酶
置换合成 T4和T7噬菌体DNA聚合酶
限制酶作图 限制酶
DNA加尾 末端转移酶
RNA加尾 poly(A)聚合酶
转录,启动子特异 大肠杆菌或SP6、T3和T7噬菌体RNA聚合酶