凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA)

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凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA)

一种基于DNA结合蛋白和靶标DNA结合的原理,研究蛋白和DNA的互做关系的实验,可用于定性和定量分析。EMSA实验多数用于验证基因的反式作用因子与顺式作用元件的互做关系,例如转录因子与启动子。这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

实验原理

将纯化的蛋白或蛋白提取液与探针混合孵育,如果蛋白和探针结合,会形成蛋白-探针复合物。用凝胶电泳的方法分离混合液的各个组分,探针迁移速率大,会堆积在泳道下方;蛋白-探针复合物因为蛋白质的存在,迁移率增大,滞留在泳道上方。因此,根据电泳带的位置判断探针是否能和蛋白结合。

EMSA实验根据实验方案设计的不同,分为验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。

验证型EMSA

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。
探针与纯化蛋白混合孵育,探针与蛋白结合与否,可以直接表明探针和蛋白的互做关系。蛋白提取液中蛋白质混杂,种类不单一,探针可能与多种蛋白结合。因此,探针与蛋白提取液混合孵育,可以验证探针上是否含有蛋白结合位点,但是无法得知是何种蛋白与探针结合。

竞争型EMSA

与探针序列相同,不含修饰基团的DNA片段称为冷探针。
在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针,冷探针含有和探针相同的DNA序列,会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处,电泳带的的信号减弱或消失。
探针和蛋白的结合未必是特异性结合,或者蛋白本身可能含有生物素,二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验,可以排除假阳性结果,增加实验结果的准确性。

超迁移EMSA

超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。
如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白,无论是验证型EMSA,还是竞争型EMSA,都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。在实验体系中引入特异性抗体,用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物,这就是超迁移EMSA。
蛋白-探针复合物被抗体识别并结合,该三聚复合物在凝胶电泳中,迁移速率再次增大,电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。
超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合,是否是特异性结合,与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。