EMSA凝胶迁移实验常见问题解析

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1.EMSA的原理是什么?

  EMSA全称是Electrophoretic Mobility Shift Assay,中文叫凝胶迁移实验或电泳迁移率实验,它是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术,可用于定性和定量分析。

  这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合,然后在跑PAGE胶,结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢,这样,从PAGE胶的电泳结果就可以判断,该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

EMSA原理

2、EMSA的具体实验过程?EMSA实验怎么做?

EMSA的实验主要分为探针制备、预电泳、电泳、转膜、洗膜、信号检测,详情可以参考EMSA案例

3.EMSA实验为何需要设置许多组对照实验?目的何在?

EMSA实验会有如下对照组:
(1)阴性对照反应(标记探针);
(2)常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);
(3)探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);
(4)突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针);
(5)Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体)。

每个对照组的目的:
(1)确定探针里面是否有杂质,光有探针,没有其他成分时,探针的位置,应该位于最下方。
(2)这个是看蛋白和探针的结合,是实验目的
(3)看探针结合的特异性。如果冷探针可以竞争结合,阻碍了标记的探针,说明2中的结合是特异的
(4)目的和3相同。突变的冷探针应该对2的结果没有影响
(5)也是判断特异性,这次是看蛋白的特异性,和抗体结合后,就会有super-shift。如果没有,说明是其他的蛋白结合。

4.看不到迁移带怎么办?

(1)标记的DNA探针量太少或者探针有降解
(2)某些蛋白和探针的结合条件比较特殊,需要优化结合体系
(3)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。
(4)样本中没有可以与探针结合的蛋白。
(5)探针与蛋白无特异性的相互作用。
(6)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。
(7)曝光或者成像时间过短。

5.实验背景为什么高?

(1)蛋白的质量不高,杂质多
(2)转膜时使用了Western Blot使用的工具,没有清洗干净
(3)TBE溶液中有悬浮物
(4)曝光或者成像时间过长。
(5)封闭时间不足或者效率不高。
(6)洗涤效果不佳。
(7)实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

6.Western Blot和EMSA有什么不同的意义

Western Blot 只是反应表达分子含量,通过免疫性进行鉴定。
EMSA是蛋白分子与靶序列核酸的结合量,反应的是该分子的生物学活性。 免疫性往往不能反应待测分子的生物学活性。 转录因子EMSA最有说服力。

7.EMSA非放射性探针设计要注意哪些问题?


(1)防止错位配对、封闭成环,排除目标序列以外结合位点的
(2)防止产生空间位阻
(3)注意AT/GC比例
(4)EMSA探针不宜太长,一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难,还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。
(5)建议采用Biotin或红外荧光标记,尽量不要采用DIG标记。,探针两端都有标记以提高灵敏度