EMSA凝胶迁移实验服务案例

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摘要

  EMSA实验的原理是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合,依据实验需要,设计标记探针、非标记探针、突变探针、蛋白特异性抗体等参照物,通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析。

1、试剂和耗材

样品: Lightshift Chemiluminescent EMSA Kit:Thermo Scientific,货号 20148。

2、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司 移液器:2.5 µl/100 µl/200 µl/1000 µl Eppendorf 公司
Gel Doc2000成像系统、垂直电泳系统 美国BIO-RAD公司 超净工作台 中国苏净集团
AR5120电子天平 美国AHOΜS公司 MultiTemp III 恒温水浴锅 雪花状制冰机 日本SANYO公司

 

3、主要实验仪器

3.1 探针制备

合成生物素标记探针(客户提供序列):

3.2 电泳

3.2.1 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制:在 15 ml 试管中,按顺序放入 ddH2O 7.15 ml ,30%聚丙烯酰胺溶液 2 ml,5×TBE 1 ml,甘油 175 μl,10% APS 75 μl, TEMED 8 μl;

3.2.2 4℃,100 V 电压预电泳约 60 min;

3.2.3 根据要求配制结合反应液,室温放置 15 min;

3.2.4 加入生物素标记的探针,室温放置 35 min;

3.2.5 加入 5 μl Loading Buffer 到每一个结合反应中,混匀,上样;

3.2.6 4℃,100 V 电压电泳,至溴芬兰电泳至 2/3 凝胶长度时停止电泳;

3.3 转膜

3.3.1 将合适大小的尼龙膜浸泡在 0.5×TBE 中 15 min,按照夹心法依次将海绵、 滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵按顺序放好,筛孔板固定,仔细去除夹心内所 有气泡,凝胶面向阴极插入电泳槽中,倒入0.5×TBE,300 mA恒流电转移30 min;

3.3.2 紫外线交联。

3.4 洗膜、信号检测

参照 LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit 说明操作。

3.4.1 50℃水浴温和地将封闭缓冲液(blocking buffer)和 4×漂洗缓冲液(Wash Buffer)预热,直至颗粒物全部溶解;

3.4.2 将膜放入洁净的塑料平皿中,加入 20 ml 封闭缓冲液,放在摇床上温和摇 动 15 min;

3.4.3 吸取66.7 μl辣根抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶底物到20 ml封闭缓冲液, 混匀备用;

3.4.4 将封闭缓冲液倒去,加入上一步所配溶液,放在摇床上温和摇动 15min;

3.4.5 取 40 ml 4漂洗缓冲溶液到 120 ml ddH2O 中,得到 1漂洗缓冲溶液;将膜 转移到一个新的塑料平皿,加入 20 ml 1漂洗缓冲溶液漂洗 5min,共漂洗 4 次;

3.4.6 将膜转移至另一新的塑料平皿,加入 30 ml 底物平衡缓冲液,平衡 5min;

3.5.7 配置底物工作液(Substrate Working Solution):将 6 ml Luminol/Enhancer Solution 加入到 6 ml Stable Peroxide Solution 中,混匀,避光保存备用;

3.4.8 将膜从底物平衡缓冲液中拿出,正面朝上放到新的洁净平皿中,将底物工 作液倒入膜的表面,避光放置 5 min;

3.4.9 将膜从底物工作液中取出,用塑封膜封好,避免气泡和皱褶;

3.4.10 机器曝光并记录结果。

3.5 实验结果

竞争性超迁移EMSA实例