DNA Pull down案例分析

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本文以钟鼎生物的实际项目案例为基础,详细介绍了DNA pull down实验的流程,共分为三大块的内容,包括实验所需的仪器试剂、实验方法及实验结果的解析,仅供参考。

试剂和耗材
样品:1个样品
TaKaRa Ex Taq:TaKaRa Biotin-11-dUTP
dATP/dTTP/dCTP/dGTP NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents:Thermo fisher
BCA Protein Quantification Kit Bioeast Mag-SA
DL2000 DNA Marker:TaKaRa VAHTS DNA Clean Beads
Protein Marker:Thermo Acr、Bis、Tris:Sigma公司
SDS:Amresco TEMED:BIO-RAD
快速银染试剂盒 其它试剂均为国产分析纯。
主要实验仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机:美国BECKMAN公司 台式高速离心机:德国SORVAL公司
Mini Protean II垂直平板电泳系统:美国BIO-RAD公司 320-S pH计:美国Mettler Toledo公司
AR5120电子天平:美国AHOΜS公司 雪花状制冰机:日本SANYO公司
超净工作台:中国苏净集团 梯度PCR仪:TP600型,TaKaRa公司
离心机:Sigma 1-14型,Sartorius公司 电泳仪:TY2795型,BIO-RAD公司
电泳槽:Sub-Cell GT Cell,BIO-RAD公司 凝胶成像分析系统:GelDocXR型,BIO-RAD公司
移液器:2.5 µl/100 µl/200 µl/1000 µl,Eppendorf公司

实验方法及结果

1、探针制备

采用PCR制备探针

引物序列:
F:5' CTATCCGGCCCAAGCTTT 3'
R:5' AATAATTCACCTTGGTGTAAC 3'(728 bp)

PCR反应体系如下:

表1 PCR反应体系     Table 1 PCR reaction system
成分 体积
10× Ex Taq Buffer(Mg 2+ plus) 5 μL
dUTP标记混合物 4 μL
F 1 μL
R 1 μL
DNA <500 ng
TaKaRa Ex Taq 0.25 μL
ddH2O Up to 50 μL


PCR反应程序如下:

表2 PCR反应程序     Table 2 PCR reaction procedure
反应温度 作用 反应时间
94℃ 预变性 5 min
94℃ 变性 30 s 30个循环
58℃ 退火 30 s
72℃ 延伸 50 s
72℃ 复性 7 min


标记探针电泳分析

标记后PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,探针成功标记后分子量增加,电泳条带滞后。结果如下所示:

案例

图1 探针电泳检测
Fig.1 Evaluation of PCR-labeled probes by electrophoresis
Lane M:DL2000 Plus DNA Marker
(从上到下:2000,1000,750,500,250,100)
Lane 1:Biotin-11-dUTP标记的探针
Lane 2:对照的DNA探针

采用VAHTS DNA Clean Beads 对PCR产物回收,待用。

2、核蛋白的提取

(1)对于贴壁细胞,用胰蛋白酶EDTA收获,然后以500×g离心5分钟。对于悬浮细胞,通过500×g离心5分钟获得;
(2)用PBS悬浮细胞颗粒,清洗细胞;
(3)将1×106细胞转移至1.5 mL离心管中,以500×g离心2-3分钟;
(4)使用移液枪小心吸取并丢弃上清液,使细胞沉淀尽可能干燥;
(5)采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Thermo fisher,货号78833)提取核蛋白,加入CER I,涡旋使细胞完全悬浮,将离心管在冰上孵育10分钟;
(6)向管中添加预冷CER II,涡旋5s,将离心管在冰上孵育1分钟;
(7)涡旋5s,在离心机(16000×g)中以最大速度离心5分钟,去上清;
(8)沉淀加入NER,充分悬浮,涡旋15秒后将样品放在冰上,每10分钟涡旋15秒,总共40分钟;
(9)在离心机中以最大速度(16000×g)离心10分钟;
(10)立即将上清液(核蛋白提取物)部分转移到干净的预冷离心管中,放在冰上;
(11)在使用前,储存在-80℃。
采用BCA法检测蛋白浓度。

3、探针与蛋白互作

实验具体分组如下:

编号 1 2 3 4 5
探针 + - + - -
Biotin-11-dUTP标记探针 - + - + -
核蛋白 - - + + +
Bioeast Mag-SA + + + + +


(1)预先混合1 µg DNA探针和70 µg核蛋白,置于冰上;
(2)取50 µl Bioeast Mag-SA,用冰冷PBS洗一次,5000×g 离心30秒; 
(3)将DNA与蛋白的混合物加到Bioeast Mag-SA中,重悬珠子; 
(4)4℃孵育1小时;
  (5)5000×g,离心30秒,去除上清,收集沉淀; 
(6)用冰冷PBS洗Bioeast Mag-SA三次,5000×g 离心1分钟,尽可能去除上清,收集沉淀;
(7)加入30 µl蛋白上样缓冲液,重悬沉淀,沸水煮10分钟。

4、SDS-PAGE检测

(1) 样品制备:样品中加入Loading Buffer,100°C 10 min。
(2) 电泳条件:5%浓缩胶:90 V,30 min;10%分离胶:120V,90 min。
(3) 电泳结束后进行银染,拍照记录跑胶图片用于分析。

5、实验结果

案例图

图2 SDS-PAGE检测分析图
Fig.2 SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1: 探针+Bioeast Mag-SA
Lane 2: Biotin-11-dUTP标记的探针+Bioeast Mag-SA
Lane 3: 探针+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 4: Biotin-11-dUTP标记的探针+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 5: Bioeast Mag-SA+核蛋白

通过SDS-PAGE银染结果检测,发现Biotin-11-dUTP标记的探针与核蛋白有明显互作,如需要进一步确认,建议进行后续的LC-MS鉴定。

以上分析仅供参考。

6、质谱检测

(1)检测对象

序号 编号 样本类型 物种
1 Control Pull-down溶液 Ovis aries
2 sample Pull-down溶液 Ovis aries

(2)检测过程

(3)检测结果

样品名称 Control sample 差异蛋白
Protein Group 230 327 132

7、生物信息学分析

针对实验组扣除对照组后的132个差异蛋白进行生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)。

(1)GO分析

根据分类结果,对包含目标蛋白最多的前20位GO条目作出统计图,不同颜色代表三个不同的本体,柱形代表该条目包含的目标蛋白数量。

案例图

图3、GO功能分类图示例

(2)KEGG pathway分析

在通路图中,绿色底为该物种中包含的蛋白,红色底为本项目的目标蛋白。不同节点间用不同连线表示不同含义。

案例图

图4、KEGG通路图示例

案例图

图5、节点间的各种关系

根据Pathway条目信息表数据,对包含目标蛋白最多的前20位pathway作分类图,柱形代表该条目包含的目标蛋白数量。

案例图

图6、KEGG pathway分类图示例

(3)String蛋白质互作网络分析

在蛋白关联网络图中,蓝色的连线表示蛋白间的联系,根据蓝色深度不同,相互作用可信度的强度也不同,颜色越深,可信度越强。

案例图

图7、String分析图

8、输出文件

输出文件 文件内容
体外转录和纯化 PCR产物琼脂糖电泳分析
转录产物琼脂糖电泳分析;
DNA pull down SDS-PAGE图
LC-MS/MS 检索结果表格.xlsx
差异蛋白表格.xlsx
生物信息学分析 GO功能注释和分类
KEGG Pathway通路注释和分类
String蛋白质互作网络分析

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