植物组织基因组总DNA提取实验步骤/注意事项

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  本文重点介绍了两种植物组织基因组总DNA提取的方法,即经典的十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)和氯化铯离心法。包括这两种方法的原理、实验材料、实验步骤,以及注意事项。

1.CTAB法

CTAB法

1.1.概述

  非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)最初被用于提取细菌基因组DNA。后来经改造用于提取植物DNA。当NaCl的浓度降到0.5 mol/L时,CTAB可以与DNA形成不溶的复合物而沉淀下来,而其他的杂质,如多糖、酚复合物则不会沉淀下来从而被除去。随后在高盐溶液中,CTAB则与DNA分离,并通过离心使DNA沉淀下来。

1.2.实验材料

2-巯基乙醇(2-ME), CTAB 抽提液,CTAB/NaCl 溶液,CTAB 沉淀液,24:1 (V/V) 氯仿/辛醇,高盐TE缓冲液,80%乙醇,TE缓冲液,异丙醇。

1.3.实验步骤

(1) 在所需量的CTAB抽提液中加入2-ME,使终浓度达2% (V/V)。将此溶液及 CTAB/NaCl溶液加热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4 mL的2-ME/CTAB抽提液和0.4~0.5mL的CTAB/NaCl溶液。而对于干的植物组织,则2-ME/CTAB抽提液须用蒸馏水稀释一倍。
(2) 用液氮或干冰冷却匀浆器,将植物组织粉碎成为细粉,然后将其转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
(3) 往粉碎的组织中加入65℃的2-ME/CTAB,充分混合,于65℃温育10~60min,不时混匀。
(4) 加入等体积的24:1氯仿/辛醇抽提匀浆液,颠倒使充分混合,于4℃ 7500 g离心5 min,回收水相。
(5) 在回收的水相中加入0.1体积的65℃的CTAB/NaCl溶液,颠倒混匀。
(6) 用等体积的氯仿/辛酵抽提,混匀,离心,回收上层水相。
(7) 加入等体积的CTAB沉淀液,颠倒混匀,如果沉淀不可见,则先于65 ℃温育 30 min 。
(8) 于 4℃,500 g 离心 5 min。
(9) 移出上清,但不要丟弃,用高盐的TE缓冲液溶解沉淀(每克组织0.5~lmL), 如果沉淀难于溶解,于65℃温育30 min,重复直至所有的或大部分沉淀溶解。
(10)加入0.6体积的异丙醇,充分混匀,于4℃,7500 g离心15 min。
(11)用80%乙醇洗涤沉淀物,干燥,用TE重悬(每克起始材料0.1~0.5mL)。

2.氯化铯离心法

2.1.概述

  这种方法的原理是采用离子去垢剂(十二烷基肌酸钠)裂解全细胞,蛋白酶K消化蛋白质。最后利用氯化铯密度梯度离心法获得基因组DNA及线粒体和叶绿体DNA。

2.2.实验材料

灭菌水,抽提缓冲液,液氮,TE溶液(PH 8.0),10% (W/V)十二烷基肌酸钠 (SDS)溶液,异丙醇,氯化铯,氯化铯饱和的异丙醇,10 mg/mL溴化乙锭,无水乙醇, 3mol/L的NaAc溶液(pH5.2),水浴锅或温箱(调至55℃)。

2.3.实验步骤

(1)剪取10~50g新鲜植物组织,并用冷的灭菌水洗涤干净,吸水纸吸干。
(2) 放入研钵中,加入适量液氮,研磨成细粉。
(3) 将细粉转移至大离心管中,加入抽提缓冲液(5-10 mL/g植物),轻轻搅拌混匀,加入1/9体积十二烷基肌酸钠溶液,使其终浓度为1%。于55℃温育2 h。
(4)于4℃ 5500 g离心10 min,将上清液转移至新离心管中。
(5) 加入0.6体积异丙醇,如无沉淀出现,则于-20℃放置30 min。于4℃ 7500g 离心15 min,弃去上清。
(6) 用9mL TE重悬沉淀,加入9.7g固体CsCl,混匀,冰上放置30min。4℃ 7500 g离心10 min,将上清转移至新离心管。
(7) 加入0.5 mL 10 mg/L的溴化乙锭,冰上放置30 min。4℃ 7500 g离心10 min, 将上清转移至两个快封(QUICK-SEAL) 5 mL超离心管中,并封口。
(8) 20℃ 525000 g离心4 h,或20℃ 300000g离心过夜,在紫外灯下用十五号针头和注射器收集DNA带。
(9) 用CsCl饱和的异丙醇重复抽提DNA以除去溴化乙锭。
(10)加入2体积水和6体积100%乙醇,混匀。-20℃放置1 h,4℃ 7500 g离心10min。
(11)沉淀用TE缓冲液重悬,加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2体积的100%乙醇重新离心,沉淀晾干后用0.5~2mL TE缓冲液重悬。

2.4.关键因素

(1) 取组织前将植物置于阴暗处1~2日,并且尽量选用较幼嫩的植物组织,以减少淀粉含量。
(2) 研磨时要不时加入液氮,保持低温,防止DNA降解。研磨要尽量充分。
(3) 组织的细粉应当在抽提缓冲液中充分悬浮均匀后才加入十二烷基肌酸钠。
(4) 第6步用9mLTE溶解DNA时可以于55℃放置不超过2h帮助溶解。离心后液体表面可能出现单独的一层,为残余的十二烷基肌酸钠,吸去即可。
(5) EB有强诱变性,操作时应注意防护及污染问题。
(6) 整个过程中的操作,如振荡混匀等,动作应当轻柔,不要剧烈地摇晃倒置等, 防止DNA断裂。

方法 优点 缺点
氯化铯离心法 可提取高纯度DNA 耗时较长
CTAB法 耗时少,得量大,泛用性强,操作简单 DNA纯度低。

  对于两种方法的选择,氯化铯离心法在进行植物组织基因组总DNA提取时,1g新鲜组织大概可以取得10~40 μg DNA,一些对DNA纯度要求比较高的实验,如荧光定量pcr、酶切连接等可以选用此法,而CTAB法正常情况下1g新鲜组织大概可以取得100-500μg DNA,对于大部分的分子生物学实验也足够适用

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