人白细胞DNA提取方法步骤/注意事项

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  本文主要介绍人白细胞DNA提取的方法,EDTA可以螯合血液中的Ca2+,阻止其凝固,随后通过蒸馏水使红细胞破裂,再用 SDS使白细胞膜破裂,并使蛋白质变性,然后用蛋白酶K消化蛋白质。最后用酚/氯仿抽提得到DNA。5 mL外周血大约可以提出40〜100μg DNA。

白细胞

1.实验材料

  EDTA (5%)(W/W),5mL外周血,蒸馏水,生理盐水(0℃),STE溶液,10% SDS (W/V)溶液,蛋白酶K,苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1),氯仿/异丙醇(24:1),3M 的NaAc 溶液(pH 5.2),70%及100% 的乙醇,TE 溶液(pH 8.0)。

2.实验步骤

(1)在50mL离心管中加入250μL EDTA溶液,将抽出的5mL血液立即加入其中。 2500 g离心5 min,去上清。也可4℃暂时保存。
(2) 加入25 mL蒸馏水,慢慢摇晃(约5 min),至管底无黏附物后3 500 g离心 lOmin,一次性倒去上清。
(3)加入15 mL冰冻生理盐水重悬洗涤白细胞,3500 g离心5 min,去上清。
(4)依次加入:①STE 4.75mL,混匀;②10% SDS 250 μL;③2%蛋白酶K 30 μL,混匀。
(5)50℃水浴消化6 h。
(6)加入5 mL 苯酚/氯仿/异丙醇溶液,摇晃5 min混匀,冰浴10 min。
(7)3 000 g离心5 min,收集上清于另一干净离心管中,加入5 mL苯酚/氯仿/异丙醇溶液,摇晃5 min混匀。
(8)3 000 g离心5 min,收集上清于另一干净离心管中,再加入5 mL氯仿/异丙醇溶液,摇晃5min混匀。3 000 g离心5min,收集上清于另一干净离心管中。
(9) 先后加入1/10体积3mol/L的NaAc及2体积无水乙醇,慢慢摇晃。
(10)将絮状DNA挑出转移至EP管内,70%乙醇洗涤后2000g离心小心弃去乙醇,并充分晾干。
(11)加入500μLTE溶液,使DNA充分溶解。

3.关键因素

(1)要做好自身防护,整个过程最好带上乳胶手套操作,防止血液污染。
(2)蛋白酶K要现配现用。
(3)酚氯仿抽提吸取上清时,尽量不要吸到下层的有机相。
(4)实验加入STE、SDS、蛋白酶K时,先加STE充分悬浮细胞,等细胞混合均匀没有沉淀后,再加入SDS,否则,DNA提取的数量和质量都不髙。因为先期出来的DNA大分子聚集成团,严重干扰了后期的消化。

4.所需时间

时间主要消耗在水浴消化,整个过程要耗时8~9h。

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