动物组织基因组总DNA提取实验步骤/注意事项

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  在分子生物学领域,诸如southern杂交等试验,提取高质量的基因组DNA是试验成功的前提,那么如何提取高质量的基因组DNA,下面就将介绍动物组织基因组总DNA提取的一种方法,包括实验原理、实验步骤、注意事项以及常见问题解析。

动物组织基因组DNA提取

1.实验材料

  动物组织或培养的细胞,液氮,裂解缓冲液,3mol/L的NaAc溶液(pH5.2), 70% 及100%的乙醇,TE溶液(pH 8.0),25:24:1的苯酚/氯仿/异丙醇,冰上预冷的PBS (样本为细胞才需要),水浴锅或温箱(调至50℃)。

2.实验步骤

2.1.样本处理

2.1.1.动物组织

(1) 切取一小块组织(0.2~1.0 g,尽量去除纤维结缔组织)并称重,尽量剪碎后放入研钵。
(2) 加入少量液氮使研钵及组织初步冷冻,然后用枪头或小木棒移动一下组织,防止其黏在研钵上。
(3) 再次加入液氮,使组织尽可能冻脆,然后在液氮即将挥发完的时候开始迅速研磨。
(4) 将组织粉末倒入装有裂解缓冲液(每100mg组织1.2mL)的离心管中。

2.1.2.培养细胞

(1) 将细胞粗略计数后收集至离心管,5℃ 500 g离心5 min,去上清。
(2) 加入等量预冷的PBS吹打匀后,5℃ 500 g离心5min,弃上清。
(3) 重复(2)步一次。
(4) 每108个细胞加入1mL裂解缓冲液(最少0.3mL)

2.2.消化

将上述离心管盖紧后放置于50℃水浴锅或温箱中(有条件可轻微摇动)。12〜18 h 后溶液应呈黏稠状。

2.3.核酸抽提

(1) 加入与水相等体积的饱和酚/氯仿/异丙醇溶液,并上下倒置混匀。1700g离心 5 min。 (2) 将上层水相小心吸出至另一新离心管中。 (3) 重复上述的两步。 (4) 加入0.1倍体积的3 mol/L的NaAc溶液及2倍体积的100%乙醇,轻轻转动离心管至溶液混匀,-20℃放置10〜20 min,DNA沉淀形成白色丝状物。 (5) 用玻棒挑出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗并晾干后,加入TE溶液(每0.1g组织或108个细胞加0.2 mL),彻底溶解后-20℃保存。

3.关键因素

(1)如果样品是肝组织,注意在取材的时候不要被胆囊污染,因为其中含有大量消化酶。
(2)第一次加入液氮时不能太多,防止组织紧紧黏附在研钵上,影响研磨;第二次加入液氮要比较多,使组织尽可能冻硬冻脆,才能研磨粉碎,而且动作要迅速,防止DNA被降解。
(3)蛋白质一定要去除干净,防止其干扰后续的酶切,必要时重复用蛋白酶K消化。
(4)用酚/氯仿抽提时应避免剧烈振荡,防止基因组DNA断裂成小片段。
(5)第二次酚/氯仿抽提时应避免吸到下层的有机相。
(6)70%乙醇漂洗完后应尽可能晾干,以免抑制后续反应。
(7)要避免对高分子量DNA的剪切,可将最后上层的水相DNA溶液用TE缓冲液作两次透析,每次24h以上。以除去有机溶剂和盐。
(8)除去残留的RNA,加入0.1%的SDS和1μg/mL无DNA酶的RNase,37℃温育1h,重复核酸抽提的步骤。
(9)最后一步溶解DNA沉淀时可置于65℃帮助溶解。

4.常见问题

(1)有机相与水相不能均匀分开,一般是由于DNA浓度太高或还残留着大量细胞的残存成分。此时应加入适量裂解缓冲液稀释。
(2)最后如果没有DNA出现,则将溶液与2000g离心3min。若还无DNA,则可能由于之前没有消化完全,可以适当增加裂解缓冲液的量。也有可能是DNA在某一步中已被降解。

5.所需时间

第一日处理组织,过夜消化,第二日即可抽提得到DNA。

分子生物学实验中,往往是这些基因组DNA提取的前期工作没做好,导致没有拿到理想的结果,所以越是基础的工作越是值得我们注意。

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