cDNA的合成方法/实验步骤/注意事项

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  cDNA合成包括cDNA第一链和第二链合成。所有合成cDNA第一链的方法都在以总RNA或者分离纯化mRNA为模板,用依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来采用 Oligo (dT)或随机引物催化合成的。本文将会介绍cDNA合成的方法、实验步骤以及注意事项。

1.方法

方法 原理 特点
自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的 DNA - RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。 不易控制
易使序列缺失或重排
置换合成法 在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成第二链。 非常有效
直接用第一链反应产物,无须处理纯化
不必使用S1核酸酶来切割单链发夹环。

2.实验步骤

2.1.cDNA第一链的合成

(1)在灭菌的无RNA酶污染的0.2mL离心管中加入如下反应混合物:
①模板RNA:总RNA 1-5μg或poly(A+)mRNA 0.1-0.5μg
②引物:Oligo(dT)18(0.5μg/μL)1 μL或随机六合引物(0.2μg/μL)1 μL或序列特异性引物20pmol。
③无RNA酶去离子水(Rnase-free ddH2O):定容至17μL

(2)轻轻混匀后离心3~5 s。
(3)反应混合物在70℃水浴5min后,冰浴30s,然后离心3〜5s。
(4)将离心管冰浴,再加入如下组分:
cDNA第一链缓冲液(5 × ) 4 μL
RNA 酶抑制剂(20 u/pL) 1 μL
dNTP Mix (10 mmol/L) 2 μL
(5)轻轻混匀后离心3〜5 s。
(6)37℃水浴5min,加入1μL M-MLV RT(20U/ μL),终体积为25 μL。吸取5 μL至另一离心管,加入2-5 μCi [α-32P] dCTP ( >400 Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
(7)反应混合物37℃水浴60 min (如果采用随机六合引物则预先在25℃温育10 min, 然后37 ℃水浴60 min)。
(8)在70℃加热10 min结束反应,置冰上进行后续cDNA第二链合成或冷冻保存。
(9)掺入测定的离心管加入95 μL 50 mmol/L的EDTA终止反应,并使总体积为 100 μL。可取90 μL进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10 μL进行同位素掺入放射性活性测定。

2.2.cDNA第二链的合成

(1) cDNA第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。取第一链反应液20 μL, 再依次加入:
10 x第二链缓冲液10 μL
DNA聚合酶I 23U
RNase H 0.8U
无RNA酶去离子水加至终体积为100 μL 。
(2)轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10 μL至另一离心管,加入2~5 μCi [α-32P] dCTP。
(3)14℃温浴2h (如需合成长于3 kb的cDNA,则需延长至3~4h)。
(4)掺入测定离心管中加入90 μL 50 mmol/L的EDTA,取10 μL进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。
(5)cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10min,低速离心后置冰上。
(6)加入2 U T4 DNA聚合酶,37℃温浴10min。
(7)加入 10 μL 200 mmol/L EDTA 终止反应。
(8)用等体积酚/氯仿抽提cDNA反应液,12000 rpm离心5min。
(9)吸取水相移至另一离心管,加入1/10体积3mol/L的NaAc (pH5.2),混匀后 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置lh。
(10)4℃,12000 rpm离心15 min,小心弃去上清。用70%乙醇洗涤沉淀。
(11)4℃,12000rpm离心5min,弃上清,室温晾干
(12)加入10-20 μL TE缓冲液溶解沉淀。

实验室卡通图

2.3.cDNA合成产物定量分析

(1)各取加入同位素反应液各3 μL,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥,这些样品代表总放射性活性。
(2)同样各取3 μL中反应液至含有100 μL (1 mg/mL)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5 mL 5% TCA,涡旋混合仪混合后置冰上5-30 min。
(3)用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5%TCA洗3次,每次用5mL TCA,再用5mL 无水乙醇漂洗,这些样品代表掺入放射性活性。
(4)分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。
(5)第一链cDNA合成产物量测定。
第一链掺入率(%)=[掺入放射性活性(cpm) /总放射性活性(cpm)] X100% 掺入 dNTP (nmol) =2 nmol dNTP/μLx 反应体积(μL) x (第一链掺入率)
设330为每mol dNTP的平均分子量,
合成 cDNA 量 (ng)= 掺入 dNTP ( nmol) x 330 ng/nmol,
mRNA 向 cDNA 转变率=[合成 cDNA 量(ng) /模板 RNA 量(ng) ] x 100%。
例如总放射性活性强度为254 000 cpm,掺入放射性活性强度为3 040 cpm,所用RNA 模板量为1 μg,反应体积为25 μL,则:
掺入率=(3040/254000) x 100% =1.2%,
掺入 dNTP 量=2nmol dNTP/ μL x25 x 1. 2% =0.6 nmol,
合成 cDNA 量=0. 6 nmol dNTP x330ng/nmol =198 ng,
mRNA 向 cDNA 转变率=(198ng/1000ng) x 100% = 19.8% 。
由于1000ng RNA中20% (5μL/25μL)用于掺入测定,而反应体积占总体积 80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8 x 198ng=158 ng。
(6)第二链cDNA合成产物量测定。除需去除第一链掺人dNTP外,方法同第一链产量计算。
除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算。
第二链掺入率=[掺入放射性活性(cpm) /总放射性活性(cpm)] X100%,
掺入 dNTP 量(nmol) = [0.4 nmol dNTP/μL x 反应体积(μL)-第一链掺入 nmol] x第二链掺入率,
第二链 cDNA 合成量(ng) = nmol dNTP x 330 ng/nmol,
双链cDNA转变率=[双链cDNA合成量(ng) /单链cDNA合成量(ng)] x1OO%。
例:第二链掺入放射性活性强度为2780 cmp,总放射性活性强度为235 000 cpm。
第二链掺入率=(2 780/235 000) x 100% = 1. 18%,
第二链合成 dNTP 量=[(0.4 nmol/ μL x 100 pL) -0. 48 nmol] x 1. 18% =0.47 nmol,
合成第二链 cDNA 量(ng) =0.47 nmol x330 ng/nmol = 155 ng,
双链 cDNA 转变率=(155ng/158ng) x100%=98%。
一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12%-50%和50%-200%为好。

2.4.cDNA合成产物电泳分析

  同位素32P标记的cDNA产物能够用碱性琼脂糖凝胶电泳来分析。合成产物和DNA分子量标准都要用32P来标记。可用DNA 5'-末端标记试剂盒进行标记。
(1)用碱性琼脂糖凝胶电泳缓冲液制备1.4%的碱性琼脂糖电泳,并置碱性电泳缓冲 液中平衡至少30 min。
(2)取样品液,用TE调整体积,使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2 x加样缓冲液(2 x加样缓冲液应在-20℃中保存或在每次使用前加入)。
(3)加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳电压为5 V/cm。
(4)停止电泳,将胶浸入7%TCA中,室温放置30 min (直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。
(5)用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。

3.注意事项

(1)为保持RNA的完整性,通常在合成第一链反应体系中加入RNA酶抑制剂以抑制RNA酶活性。 (2)cDNA合成引物的选择很关键,根据不同实验需要选择引物。当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板,PCR引物 在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。   Oligo (dT)引物是一种对mRNA特异的方法。最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若 PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。 用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。

  最后,cDNA合成有着广泛的应用,可用于cDNA文库构建,分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA探针、构建RNA高效转录系统等。掌握它的实验步骤与方法是很有必要的。

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