载体改造

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    实验室现有载体资源能解决大部分实验需求,只有在极少数的情况下需要对现有载体进行改造。载体改造,顾名思义就是首先需要找到一个尽可能与需求类似的载体做骨架,然后分析现有载体上已经包含的元件,还需要引入何种元件,需要引入的元件就是外源片段。一般情况下,引入的元件必须完整,即需要合适的启动子、多克隆位点以及终止子(可以分别扩增或者酶切得到这些片段,然后依次连入现有载体)。其实,如果对基因融合以及普通载体构建比较熟悉,改造载体只是个需要认真分析序列的连接反应。所以,在此仅介绍几个可能会遇到的问题及对策。

1 .如果需要连入一个超小片段,怎么办?

    对于超小片段,比如小于 50bp ,实际上没有必要去酶切或者扩增了,直接像设计引物一样合成便可以了。具体的讲,就是将这段序列的两条链看成两条互补的引物,分别进行化学合成。但是需要在设计引物的时候保证两条序列互补后能形成合适的末端,这种末端要能够和经酶切的载体上含有的末端形成匹配,这一点至关重要,如此才能连入所需的载体。引物合成后,将两种引物(及两条链)进行等量混合,然后95℃加热10min,室温冷却,便可以形成互补的双链。后面的步骤和普通连接相同。

    实际上,不光是超小片段,对于某些特殊实验需要引入完全人为设计的片段时也可以使用上述方法。

2 .遇到外源片段中含有所需酶切位点怎么办?

    实验中常遇见的问题之一就是外源片段中含有所需的酶切位点,正常的酶切会破坏外源片段。对于内部含有酶切位点数目很少的(1~2个),可以使用部分酶切获取外源片段。
    比如一个1Kb的片段,想使用BamH I和Hind III酶切,但内部400bp处含有一个BamH I,怎么办?
    首先,使用Hind III对含有外源样品充分酶切(保证酶切完全)。
    然后,对反应产物进行BamH I部分酶切。部分酶切有两种途径,一种是减少反应时间,另一种是减少酶量。这里重点介绍后者,因为效果稳定可靠。

载体改造

    这种方法实际上是一种浓度梯度稀释。比如100ul经过Hind III酶切的产物,平均分成4份。向第1号管子中加入5U的BamH I,混匀。从这一管中取出8ul出来,加入第2管子,混匀。依次进行到最后。将4个管子在37℃反应15~20min,加入Loading Buffer 终止反应。这样如果每管取部分产物跑胶检测的话,一般1号管已经完全酶切,出现400bp和600bp条带;2号管或3号管将出现明显的1Kb部分酶切条带,当然也有400bp和600bp条带;最后4号管中可能大部分是没有产生酶切的条带。最后选取出现条带的产物进行挖胶回收便可得到部分酶切的外源片段。