1、BLI实验中固化方法有哪些？各有什么优劣势？

直接固化	抓取固化
优势： ● 非常稳定的固化 ● 所有蛋白都可以进行固化	优势： ● 不会产生共价键，易于保持蛋白活性 ● 可以固化在粗样品的蛋白 ● 固化的有序性 ● 将固化蛋白与分析蛋白-并再生，回传到传感器原始状态
劣势： ● 需要纯化的蛋白 ● 无序的固化 ● 产生共价键，可能对蛋白活性有影响 ● 再生时需要考察固化蛋白的耐受性	劣势： ● 固化的密度少于前者 ● 固化稳定性弱于前者

2、BLI技术可以提供哪些信息？

1. 分子特异性结合
目标分子间是否存在特异性结合?

2. 结合亲和力(Affnity)
分子结合的紧密程度?K_D、K_A候选分子排序

3. 结合动力学(Kinetics)
分子互作反应的速度?K_a、K_d

4. 浓度分析
目标分子有多少?

3、BLI技术相对ELISA方法具有哪些优势？

	ForteBio (Octet RED96e )	ELISA
时间	1小时	4-8小时，抗体标记不计
是否需要标记	否	是
自动化程度	高	低
样品是否可以重复使用	是	否
抗原耗量	1-5ug	10ug
是否有配套分析软件	是	否
抗体是否做梯度	否	是
弱亲和力配对	是	否
是否可以实现粗样品配对	是	否

4、BLI实验需要的样品有哪些要求？

样品的均一性	蛋白理化性质	缓存液成分	亚型/标签类型
确保样品充分水溶，样品中没有任何沉淀、颗粒——保持样品处于均一的、不聚集的状态	纯度(>90%)，蛋白浓度 >0.2mg/ml，浓度越高越好； 明确等电点/分子量信息	分析物样品中不能含有不要含有高浓度的高聚物物质如PEG等; 氨基偶联的配体溶液中不能含有tris、NaN3、甘氨酸等成分； APS 传感器(膜蛋白相互作用研究)的固化缓冲液不得含有任何去污剂	如果配体或分析物是抗体，请告知抗体亚型及种属； 如果配体或分析物是蛋白，请告知标签类型

5.BLI可研究的生物分子范围？

蛋白质、DNA/RNA、 脂类 /脂质体/ 生物膜、多糖、多肽、小分子、全细胞/病毒/微生物

钟鼎目前可以检测的亲和力范围：

① 亲和素-生物素结合: 10^-14M;
② 强的抗原-抗体结合：10^-8 ~10^-10 M;
③ DNA 与蛋白的结合：10^-8 ~10^-10 M;
④ 较弱的抗原-抗体结合：10^-6 ~10^-7 M;
⑤ 蛋白与小分子结合：10^-3 ~10^-6 M。

6、BLI实验中遇到非特异性结合怎么办？

在BLI实验中，通常的非特异性结合有两类。

① 分析物直接与固相介质（传感器）结合；
② 分析物缓冲液中的杂志与固化物结合。

改善或消除非特异性结合的方法有以下几种，可以根据具体情况进行尝试。

（1）继续优化反应缓冲液，第一种是摸索合适的pH条件；提高盐离子浓度；第二种是增加表面活性剂的浓度，非离子型如Tween-20，最高至0.05％。
（2）增加一步封闭，在反应缓冲液中加入BSA ，浓度 1-2%；如果BSA有干扰，可以用其他封闭缓冲液替代，如PEG、脱脂奶粉替代或其他市售封闭缓冲液。
（3）尽可能提高分析物的纯度，去除杂质。
（4）固化物和分析物尝试对换。
（5）当使用SA/SAX/SSA生物传感器时的NSB，可以在生物素化的捕获分子固化到传感器上后,用biocytin 封闭残留的链霉亲和素位点。
（6）当使用血清样品时的NSB，可以在血清样品结合之前使用相同浓度的阴性血清作为基线。

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