1.为什么有些基因在原生质体中定位显示无信号或信号弱？

不同的基因之间表达上存在很大的差异，且表达时间也各有不同，针对无信号的结果，我们建议至少重复两到三次实验，如果还是没有结果，建议烟草叶片侵染，因为有些基因对原生质体有一定毒性，且在原生质体中表达时间比烟草短，其次原生生物和真核生物对相同的基因的表达存在一定差异。针对信号弱的结果，我们建议在载体构建上，增强启动子，并至少重复做两到三次转化。

2.什么样的基因适合在原生质体里做定位，什么样的基因适合在烟草植株中做定位？

一般大家会根据自己研究的物种来选择使用什么受体，原生质体是没有细胞壁的不完整的植物细胞，所以对外界逆境反应很敏感，所以有些基因表达后蛋白对原生质体有一定的毒性作用，导致无法观察到荧光；在烟草体系中，因为是注射法浸染烟草细胞，这样完整的植物细胞对逆境的抗性更强，所以表达后容易观察到荧光。如果有些基因表达时间较长，则更适合在烟草中操作；烟草细胞中细胞壁、细胞质和细胞膜等都会挤在一起，不便于区分；所以定位到具体细胞器的基因更适合在原生质体中表达，观察更明显。

3.为什么有时候会出现亚细胞定位结果与预测结果不符的情况？

各种基因预测定位的都是基于现有的生物学数据和已有的生物学知识，在不同的模型或算法基础上建立的不同分析程序有一定的适用范围和相应的限制条件，生物信息学的预测结果只能作为参考，为后续试验提供研究思路，但具体的表达情况还是有所差异；而且有些蛋白是会在多种细胞器中穿梭行使功能，所以定位于多种位置上也是正常现象

4.在烟草BIFC中什么样的光才算有效光？

在制片过程中时，尽可能清理干净叶片表面的杂质，排除气泡；看显微镜时，激发光电压不能打得太高，烟草细胞的轮廓清晰可见，且分布均匀。

5.为什么有些基因预测互作且在酵母双杂中显示互作，但BIFC结果显示无信号？

由于在酵母双杂实验中BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达，导致最后的实验结果出现假阳性。有些重组还可能会破坏蛋白之间的互作，且不同外源基因的瞬时表达效率大不相同，建议在BIFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。

6.BIFC结果无信号或信号弱怎么办？

首先确认载体是否有问题，甚至可以对调N端和C端的目的基因。有些基因表达时间长，在原生质体中表达不明显，可以尝试在烟草体系中表达，且适当调节观察时间，以便观察到更明显的结果。

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