杆状病毒表达载体系统应用

　　基于昆虫杆状病毒表达系统自身的特点和优势，目前已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域，近几年的研究也表明 AcMNPV 病毒也可作为哺乳动物基因治疗的载体。因此，杆状病毒表达系统的应用范围将进一步扩大。

在疫苗中的应用

　　昆虫杆状病毒表达载体系统具有重组蛋白表达量高、蛋白翻译后修饰全面、适合大规模生产等优势，故其在疫苗研发方面获得了广泛的应用。

　　2009 年，美国食品和药品管理局(FDA)批准了第一个利用昆虫杆状病毒表达系统生产的人用疫苗——Cervarix 的上市，该疫苗以由人乳头瘤状病毒(HPV)16、18 型 L1 蛋白所组成的病毒样颗粒作为主要成分，以 AS04作为佐剂，临床研究表明其能诱导产生针对 HPV16、18 型的高滴度 IgG 抗体，并对 HPV 16、18 型的感染能提供 100%的保护。目前已上市的利用昆虫杆状病毒表达系统生产的疫苗见表1。

　　另外，2013 年 1 月16 日，FDA 宣布已批准 Flublok 用于 19 至 49 岁人群季节性流感的预防，Flublok 也成为第一个用昆虫杆状病毒表达系统和重组DNA 技术制造的三价流感疫苗。

　　目前也有许多利用昆虫杆状病毒表达系统且正在进行临床试验的项目，并取得了一定的进展。Glenn 等 以 Sf9 细胞表达的呼吸道合胞病毒 F 蛋白作为主要成分的疫苗进行了随机、双盲和安慰剂对照的临床 I 期试验，结果表明疫苗耐受性好，没有明显的剂量依赖的毒性和严重不良反应，与对照组相比，免疫组人群的血清中抗 F 蛋白抗体的水平有7 ～19 倍的提升，良好的安全性与免疫原性也为临床 II、III 期试验奠定了基础。

在抗体研发中的应用

　　昆虫杆状病毒表达系统所表达的蛋白具有正确的糖基化修饰和完整的生物学功能，且重组蛋白表达量高、重组表达载体构建快、成本也相对较低，这些特点都能满足研发与生产治疗性抗体的需要 。作为一种具有完整翻译后修饰功能的真核表达系统，昆虫杆状病毒表达系统在表达人源化抗体的时候经常能使其以可溶的形式分泌表达，尤其是表达不完全抗体片段(如 Fab、ScFv 等)时。研究表明，在 High Five 细胞系中，与蛋白二硫键异构酶(PDI)或人热休克蛋白 Hsp70 共表达可提高 IgG 的分泌表达水平，这可能与 PDI 和 Hsp70 能帮助抗体片段形成正确折叠有关。Shao 等利用 Bac-to-Bac 系统成功表达了具有结合人 SW480 和 SW620 结直肠癌细胞能力的 CO17-1A 单克隆抗体，并优化了CO17-1A 单克隆抗体在 Sf9 细胞中表达的条件，为结直肠癌单克隆抗体治疗效果的评价奠定了基础。

　　Palmberger 等利用 Sf9 细胞、High Five 细胞、SFSWT-1 细胞 3 种昆虫细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达人抗 gp41 抗体 3D6，结果表明，3 种昆虫细胞系与 CHO 细胞一样，所表达的抗体 N-聚糖都具有岩藻糖残基，尤其是 High Five 细胞，表达产物具有高含量的核 α1，3-岩藻糖，这说明要优化抗体表达的糖基化修饰，必须对昆虫细胞系进行必要的糖基化改造。Juliant 等。

　　将 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 I(GNT-I)基因、GNT-II 基因和 β1，4-半乳糖转移酶(β1，4GalTI)基因添加至杆状病毒基因组中，并利用这种改造后的重组杆状病毒成功表达了具有半乳糖基化的抗体。

　　相比于感染悬浮培养的昆虫细胞，利用重组杆状病毒直接感染昆虫幼虫通常能带来更佳的表达效果。Sebastian 等利用粉纹夜蛾幼虫表达了 2 种针对 A 型轮状病毒 VP6 蛋白的单域重链抗体(VHH)3B2 和 2KD1，表达量分别占总可溶蛋白的2.62% 和 3．63%，体外和体内检测表明，重组抗体具有完整的生物学功能，能中和 A 型轮状病毒，并使注射过抗体的小鼠后代能抵抗轮状病毒所引起的腹泻。

　　要制备成商品化的治疗性抗体，将昆虫杆状病毒表达系统进行扩大化培养势在必行。Wang 等用重组了针对 H5N1 型流感病毒血凝素(HA)单克隆抗体基因的表达载体转染果蝇施耐德 2细胞，并筛选出了稳定转染的细胞株，对其在生物反应器中采用批次培养和灌注培养两种方式表达重组抗体，最终批次培养收获了 201mg 蛋白，而灌注培养收获了 8212 mg 蛋白，所表达的重组抗体均具有完整的中和活性，为治疗性抗体在昆虫杆状病毒表达系统中进行扩大化培养策略的选择奠定了基础。

　　杆状病毒表面展示技术是新近发展起来的一项技术，它以外源蛋白与杆状病毒外壳蛋白或囊膜糖蛋白融合，从而将外源蛋白表达于杆状病毒表面，通过筛选得到有特异性外源蛋白表达的杆状病毒粒子，并能构建特异性外源蛋白库。杆状病毒表面展示系统属于高等真核生物展示系统，可弥补原核展示系统的不足，并保持表面展示系统的优点。利用杆状病毒表面展示技术，将抗体片段表达于杆状病毒表面，无疑是一种有效的筛选和生产高亲和力和高特异性抗体的手段。

在基因治疗方面的应用

　　基因治疗是指向靶细胞或组织中引入外源基因 DNA 或 ＲNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。目前研究较多的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒等。在重组病毒制备、外源基因插入长度、感染细胞特异性、转导效率、免疫原性、细胞毒性和安全性等方面的缺陷限制了它们的使用。尽管杆状病毒仅感染无脊椎动物，还未有直接的证据表明其对脊椎动物也具有感染性，但杆状病毒却具备进入许多非昆虫细胞内的能力，只是它只能够在昆虫细胞内才能复制与释放。进入非昆虫细胞内的机制很可能是通过与不同细胞表面的物质进行非特异性结合而实现的，如硫酸乙酰肝素蛋白多糖和磷脂等，这使得杆状病毒作为一种新的基因治疗传递载体成为可能。研究表明，杆状病毒可以转导非分裂期细胞，主要是在 G1 期向 S 期过渡的阶段，这使得其作为基因治疗载体的效率更高。构建一个含有 CMV 启动子启动的绿色荧光蛋白基因的重组 AcMNPV，并用其作为基因转移载体转导哺乳动物原代椎间盘细胞。体内实验表明，杆状病毒能有效转导兔的椎间盘细胞，同时不具有毒性。杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关，其介导的外源性基因能在正常与退变的髓核细胞中高水平的表达。体内外的实验证明，杆状病毒能进入人椎间盘细胞中并介导外源基因的高效表达，并证明了 Sox9 基因对椎间盘退化的治疗效果。这表明杆状病毒可以开发成一类高效、安全的基因治疗载体。

　　杆状病毒用于基因治疗载体的安全性高，在没有选择压力存在的情况下，杆状病毒不会像逆转录病毒一样将基因组整合到宿主细胞中，所以不会引起细胞的转化与癌变。但杆状病毒易被血清中的补体迅速灭活，所以其更适合于免疫赦免区的基因治疗，如脑、眼和睾丸，因为这些部位都具有血屏障，能保护杆状病毒免受补体的影响，这也使得杆状病毒用于基因治疗载体在中枢神经系统性疾病中的应用将会更加广泛。

在生物农药方面的应用

　　化学农药的普遍使用使市售蔬菜水果大部分含有残留的化学农药，给人们的健康带来了严重的影响，杆状病毒是节肢动物的天敌，相比于化学农药，昆虫病毒杀虫剂的使用量要小很多，且与化学农药不同的是，昆虫对于杆状病毒的抗性比较弱，不会产生明显的耐药性，对人类和自然环境也比较温和，不易引起大规模的生态平衡的破坏，因此，利用其作为杀虫剂已经成为现今生物农药研究的热点。野生型杆状病毒因其杀虫的速度较慢，有必要进行重组改造。20 世纪90 年代早期已逐渐发展了一些重组了细菌、螨虫、蝎子和黄蜂的毒蛋白基因的杆状病毒，这些重组的杆状病毒的杀虫效应有了一定的提高，发挥效应的速度也有所加快。但由于重组杆状病毒多利用多角体启动子来进行表达，其多角体基因已被删除，故相比于野生型杆状病毒，其对自然环境具有更高的敏感性，所以在选择使用野生型杆状病毒和重组型杆状病毒作为生物农药时要做综合考虑。

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