RNA提取常见问题解析

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1.无RNA沉淀

(1) 匀浆不完全

匀浆不完全时,基因组DNA分子仍然很大,溶液黏稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成累状凝集物,容易包裹RNA,使之不能有效地释放到溶液中。

(2)沉淀不完全

从小于2X10个动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时,匀浆体积太大,将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时,应按比例减少抽提溶液。

2.抽提率低

(1)系统超负荷

如果过多增加单位体积内的样品量,将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大,使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难,降低RNA沉淀效率。
(2)样品均化或裂解不完全
匀浆不完全时,RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹,不能被有效释放。
(3)RNA不完全溶解未溶解的RNA丢失。

(4)样品未及时处理或细胞生长过度

样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活,细胞生长过度同样会激活细胞内的RNA酶,若不及时提取RNA,大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取,应立即用液氮冷冻,置-80℃储存。

3. A260/A280<1.65

(1)在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。
(2)样品匀浆化时所加的Trizol量太少。
(3)匀浆化后样品没有在室温下放置5min。
(4)分离的水样层中污染有苯酚层。
(5) RNA没有完全溶解。

4. RNA降解

(1)从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。
(2)用于抽提的样品,或抽提的RNA样品没有存放于-70℃。
(3)细胞经胰酶消化面分散。
(4)水溶液或试管污染有RNA酶。
(5) RNA在水溶液中呈酸性,易自发水解,应溶于TE,-20℃以下保存。

5.DNA污染

(1)样品匀浆化时所加的Trizol量太少。
(2)用于抽提的样品包含有机溶媒(如乙醇,DMSO),强缓冲液或碱性溶液。