SYBR Green I荧光染料法

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SYBR Green I方法

    SYBR Green I方法是目前最为常见的荧光染料,其作用原理为:SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料,并不与单链DNA链结合,而且在游离状态不发出荧光,只有掺入DNA双链中才可以发光,因此,在PCR体系中,随着特异性PCR产物的指数扩增,每个循环的延伸阶段,染料掺入双链DNA中,其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关(见图1-1)。基于SYBR Green I染料法的荧光定量PCR的最大优点是通用性强,适用于所有的荧光定量PCR反应,同时,其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时,该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合,发出荧光,从而干扰对特异性产物的准确定量。但是通过对PCR产物的熔解曲线进行分析,使非特异性扩增的问题得以解决,从而保证荧光信号的特异性。Tm值得概念:Tm为DNA解链一半时的温度,不同的双链DNA由于其碱基组成不同,长度不同,因此Tm值也不同,据此可以判断是否获得同一PCR产物(见图1-2),当非特异峰Tm>特异峰Tm时,一般为非特异扩增,当非特异峰Tm<特异峰Tm,或者在72℃左右时,一般为引物二聚体,当然最后要依据琼脂糖电泳的结果进行验证。

荧光阈值

    在PCR过程中,SG染料只有在延伸阶段形成双链时,才通过和双链DNA的小沟结合,在激发情况下发出荧光,在变性和退火的单链状态时,不能发出荧光。荧光量与产物中双链的量呈正相关。

荧光阈值

    结合有染料的双链DNA随温度的升高逐步解链后不再结合染料,因此,荧光强度(纵坐标)随温度(横坐标)的升高而减弱。将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT),即得Tm值,对应图中的熔解曲线峰图。左图表明产物的特异性,右图熔解曲线分析出现非特异峰,说明有引物二聚体或者非特异扩增,导致定量不准确。