荧光定量PCR相对定量的应用领域

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    目前,实时荧光定量pcr在科研、诊断、医疗等众多领域得到广泛的应用,根据实验目的定量分析类别将其应用大致划分为三类。即荧光定量pcr绝对定量的应用领域、相对定量的应用领域和荧光定量pcr实验的规范化和精细化发展趋势,本文介绍荧光定量pcr相对定量的应用领域。

一、基因的表达研究
    qPCR方法能检测各种组织细胞中基因的表达手度,从而分析基因的表达调控,监控mRNA表达模式,比如,定量分析基因在不同组织中的转录水平;研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响;通过比较正常组织与肿瘤早期和良性阶段就可出现的癌基因的mRNA含量变化,对于肿瘤的早期诊断和治疗效果及预后的判断进行有效分析。具体实例参见荧光定量PCR应用实例部分。

二、microRNA定量分析

    microRNA对机体在应激、感染、癌症和辐射各方面的调节作用已经得到肯定,并且在临床诊断和治疗中的应用具有巨大的前景。实时定量PCR检测系统的出现,对于microRNA检测技术和表达量分析有着巨大的优势,2005 年,PCR技术可以针对成熟mi-croRNA进行定量,之后,分别针对成熟microRNA分子和前体分子进行定量;此外,检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1~10ng 的总RNA或50pg左右的microRNA;超宽的线性范围,可跨越7个数量级,利用U6等内参基因,在microRNA的定量分析中已日益成熟。现有的microRNA定量检测试剂盒有ABI (利用茎环探针技术)、Exiqon (利用锁核酸的特异性引物和SYBR Green I染料法)、Qiagen公司等,其原理各不相同,具体见图1-1。

微滴式数字PCR工作流程图

     以鉴定miRNA过表达稳定细胞系为例,简要阐述利用Exiqon公司的miRNA的反转录和定量试剂盒Exiqon试剂盒对miRNA定量检测的步骤。

     ①提取miRNA。针对单层培养细胞,每6cm2培养皿细胞加0.7mLQIAzolLysisRea-gent溶液。上述样品振荡10s后室温放置5min。加人0.4mL三氯甲烷溶液,剧烈振荡15s,室温放置2~3min。12000g, 4C离心15min。小心将上层水相加人一-个新的EP管中,加入1.5倍体积的100%乙醇后吹打混匀,将混合液加人RNeasy Mini柱子中,8000g 室温离心15s,弃废液,加入0.7mL Buffer RWT,8000g室温离心15s, 弃废液,用0.5mL Buffer RPE清洗柱子两次,将柱子放入一支新的EP管中,12000g温室离心1min,晾干柱子5min,将柱子放人新EP管中,加入30~50μL无RNase水,12000g 室温离心2~3min,收集洗脱液即为RNA。

     ②反转录。取总RNA 4μL (20ng),加入5X仅应缓冲液4μL、Enzyme mix 2μL、无RNA酶水10pL,加入PCR管中。设置PCR仪,42°C反应1h, 95°C灭活5min,利用试剂盒提供的特异反转录引物获得cDNA。

     ③Real-time PCR。内参基因U6和特异基因miR-410引物购自Exiqon公司。按下列组分配制PCR反应液(20pL 体系): 10pL 2X Quanti Tect SYBR Green Master Mix、1μLcDNA (100 ng)、1μL(混合引物(10pmol/L)、 8μL DEPC水;将样品加人到Real-timePCR的专用PCR管中后,设置PCR反应条件为: 95°C 15min, 94°C 15s, 55°C 30s,70°C30s, 45 个循环。完成Real-time PCR后对其熔解曲线进行分析。数据按2-∧∧Cq公式计算出基因表达的相对量。