荧光定量PCR绝对定量的应用领域

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    绝对定量获得的是样品的绝对拷贝数,通常应用在一些需要精确拷贝数研究和应用方面的领域,如病毒、病原体的检测,以及药学领域中对一些核酸治疗剂药物的药代动力学评价方面,下面分别简述。

(一)对病原体拷贝数定量分析中的应用
     对于病毒感染性疾病,如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)等,经典酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA), 只能对患者血清中各抗原和抗体相对浓度进行定性与半定量分析,对于患者体内病毒是否处于复制期、病毒复制量等情况,无法做出准确的评估与判断。目前,基于实时荧光定量PCR技术的HBVDNA病毒检测试剂盒(定量范围10~105拷贝/mL),已经广泛应用于HBV患者的诊断和治疗中。根据血清标本中HBV的DNA拷贝数绝对量的变化,可以准确判断患者病毒复制能力和传染性强弱,并且可以调整治疗方案。

     丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,ICV) RNA病毒载量的确定目前也多用实时荧光定量PCR方法进行。不同HCVRNA定量检测法可用拷贝/mL和IU/mL两种表示方法,两者之间进行换算时,应采用不同检测方法的换算公式,如罗氏公司Cobas V2.0的IU/mL与美国国立遗传学研究所的SuperQuant拷贝数/mL的换算公式是:IU/mL=0.854X拷贝数/mL+0.538。HCV载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性,但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。

     除乙型和丙型肝炎病毒外,国内外公司或科研机构还对包括人类免疫缺陷病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的序列结构均进行比对设计,针对其保守结构设计特异的引物和探针,并经过筛选、验证保证结果的特异性和准确性。科研单位和医院均可以通过市售获得上述基于荧光定量PCR技术的定量检测试剂盒,积累大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展、治疗和预后之间关系的资料,为人类疾病的诊断和治疗做出巨大的贡献。以下为例,简要说明操作步骤。

①检测原理。从人血清或血浆中提取乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA),在引物的引导下,以dNTP为底物,通过耐热DNA聚合酶的酶促作用,对HBV DNA进行体外扩增。在体系中采用TaqMan探针法并结合竞争性内标技术来定量检测人血清或血浆中HBV DNA的数量。

②核酸提取。取待测样本血清或血浆各100μL,加入到0.5mL离心管中,加入100μL DNA提取液A和5μL内标(含有适量的非HBV基因片段的非传染性DNA)振荡混匀,13000r/min离心10min,吸弃上清;再加入25μL DNA提取液B,振荡10s,100°C干浴或沸水浴10min, 13000r/min 离心10min, 保留上清,样本裂解产物保存在一20°C。

③PCR体系和PCR反应。设所需要的管数为n, n=样本数+1管阴性对照(HBVDNA阴性的混合血清)+阳性工作标准品[含有特定浓度的HBV基因片段的非传染性DNA,浓度为(1~5)X107 拷贝/mL、(1~5)X106 拷贝/mL、(1~5)X105 拷贝/mL、(1~5)X104拷贝/mL、(1~5)X103 拷贝/mL],每个PCR反应体系的配制如下: HBVPCR反应液(含有引物、探针和dNTP) 37.7μL, Taq酶0.3μL,UDG酶0.1μL。上述反应液按照n份混匀后,以每管38μL分装至200μL PCR管中,并分别加入阴性对照品、标准品以及提取好的未知样品核酸提取物2μL。

PCR反应程序如下: 37°C 5min; 94°C 2min; 95°C 5s; 60°C 40s;并将95C 5s; 60°C40s程序重复40个循环。

④HBV拷贝数定量结果判定。首先,设定阈值线,以基线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,且拷贝数=0拷贝/mL为准(即Cq值不出现任何数值);其次,各标准品的Cq值均应≤36,否则实验结果视为无效;最后,以5个工作标准品的拷贝浓度的对数值为横坐标,以各自对应的Cq值为纵坐标拟合标准曲线,标准曲线的拟合度应小于等于-0.980,否则视为定量结果无效。未知样品的Cq值要落在上述标准曲线定量范围内,如Cq值小于(1~5)X107拷贝/mL对应的Cq值,应用正常人血清按10倍梯度做相应稀释,使其拷贝数落在上述标准曲线定量范围内再重新测定,测定结果应以稀释倍数进行校正,获得未知样品的HBV DNA含量拷贝数。

(二)核酸药物新约开发与评价中的应用

     在新药的研发过程中,对其生物体内的药物代谢与动力学评价是其研究和申报的重要内容之一。随着生物技术药物的迅猛发展,核酸治疗剂在基因治疗中扮演着越来越重要的角色,对其生物安全性、生物分布等研究也是关注的热点之一。目前常见的核酸治疗剂主要有质粒DNA疫苗、CpG免疫佐剂、DNA寡核苷酸类药物以及可能成为药物的microRNA和siRNA类药物。在利用实时定量PCR技术对质粒DNA进行生物学分布的研究中,由于考虑到样品中<10拷贝很难可靠定量以及存在的各种原因造成的PCR抑制效应,FDA的生物制品评估与研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research, CBER)建议qPCR对于质粒DNA的可靠定量低限(Limit of lower quantification, LLOQ)是50~100拷贝/μggDNA (基因组DNA, genomic DNA, gDNA)。 在该类研究中,重要的难点之一就是要确保生物基质效应对目标基因的定量检测的影响是一致的,因此,通常需要在不同生物基质中建立标准曲线,再根据标准曲线对相同生物基质中的目标基因拷贝数进行测定。而各生物基质中的标准曲线的建立又需要一个可以归一的指标,经过实验证明,100ng 的基因组DNA较为适合作为这类归一指标。目前该方法已成熟地应用在外源性核酸药物的临床和非临床评价研究中。

     以利用实时定量PCR技术研究DNA疫苗在小鼠体内的生物分布为例,简要展示定量PCR技术在该类核酸药物药代动力学评价中的应用。

     ①利用标准品,在空白基质中通过制备标准曲线优化PCR条件。pUMVC3-Gag质粒作为荧光实时PCR绝对定量方法中的标准品,稀释成109拷贝/μL作为储存液分装,质粒拷贝数(plasmid copy number,PCN)计算公式。

     PCN=(6.02X 1023拷贝/mol)X DNA量(g)/[DNA长度(bp) X 660g/(mol•bp)]。

     将标准品系列稀释成107~10拷贝/pL作为模板,可以设计不同的引物对及浓度,优化不同的退火温度及时间,最终根据标准曲线制备的斜率和拟合度,确定最优条件,最终反应如下。

     PCR反应体系:标准品1μL. (相当于107-10拷贝),2X SYBR Green I PCRmix10μL;引物10μmol/L各0.3μL, ddH2O补足20μL体系。

     PCR反应程序: 50°C,2min; 94°C,10min; 94°C,30s; 56°C, 30s; 72°C, 30s;读板收集荧光数据;从第三步骤起重复38个循环;熔解曲线分析。

     ②提取各小鼠组织基因组,在生物基质中制备标准曲线。提取小鼠各组织中的基因组DNA (gDNA),均稀释至100ng/pL, 在不同组织提取的gDNA中进行标准曲线扩增(107-10拷贝),获得各生物基质中的标准曲线用于定量。阴性对照中以ddH2O替代标准品,在无污染且阴性对照Cq值大于各标准品产生的Cq值时认为结果有效。PCR反应体系如下。

     标准品1μL(相当于107~10拷贝),gDNA 1μL,2X SYBR Green I PCRmix 10μL; :引物10μmol/L各0.3μL,ddH2O补足20μL体系。

     PCR反应程序同上。

     ③基于各组织中标准曲线对小鼠体内质粒DNA分布进行定量。核酸疫苗免疫小鼠,不同时间点解剖,获取不同的组织,提取gDNA,均稀释至100ng/pL, PCR 反应体系和程序同上。根据各自程序的标准曲线回算各组织中不同时间点情况下质粒的拷贝数,得到该核酸疫苗在小鼠体内的生物分布图。

(三)转基因产品中的应用

     利用基因工程技术改变基因组构成,将优良的外源基因导人植物、动物或者微生物体内,改造其遗传物质,使其性状、营养价值或品质向人类需要的目标转变,是目前研究的热点之一。虽然转基因产品已经获得上市,但是对于转基因产品的安全性问题一直存在诸多争议,因此,对转基因产品需要进行有效的标识管理,并对其中的外源基因含量加以精确定量和限制,均依赖于灵敏准确的基因检测与定量技术。利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。

     进行转基因成分定量分析时,依据所检测的外源目标序列的不同,转基因食物实时荧光定量PCR检测水平可分为4种:通用序列检测、基因特异性序列检测、结构特异性序列检测和品系特异性字列检测。通用序列检测主要是检测调控基因序列(如启动子、终止子等)和抗性标记,最终检测特定转化的靶基因。基因特异性序列是指插入的外源特异性基因内部的一段序列;结构特异性序列则是指插人载体的外源基因间2个元件的连接区域序列;由于相同的转基因外源表达载体在转化过程中,可能以1~2个或多个拷贝的形式插入不同或相同的植物基因组中,形成具有相同性状的不同转基因品系,因此,上述3种检测方式均不能特异性地区分具有相同性状的转基因植物及其品系。

     品系特异性序列,即外源插入载体与植物基因组连接的边界序列,由于每一个转基因植物品系都具有这个特异的连接区序列,且该序列为单拷贝,因此,品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。目前,商品化转基因作物已经陆续建立品系特异性检测方法,如转基因大豆、转基因玉米、转基因马铃薯等。但是基于实时荧光定量PCR的转基因成分测定方法,通常是以转基因材料的标准品与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配置而成,从而获得一系列质量分数的标准品,从而建立标准曲线,对样品进行相对定量检测,因此,除了目前商品化常用的转基因品系(如MON810玉米、Bt 玉米、RRS大豆等),研究者亟需构建获得相应品系的质粒标准品作为实时定量的前提。

     以利用商品化TaqManTM PCR Bt176定量检测试剂盒为例,简要展示定量PCR技术在测定转基因玉米Bt176品系转基因含量的应用。

     ①基因组DNA的提取。采用北京鼎国有限公司生产的GMO基因组DNA提取试剂盒提取待测样品中的基因组DNA,采用紫外分光光度法测定浓度。

     ②对试剂盒中Bt176玉米含量分别为0.1%、0.5%、2.0%和5.0%的标准样品和待测样品进行cry1Ab和Zein实时荧光PCR,Taq Man探针及引物均采用Taq-ManTM PCRBt176定量检测试剂盒。

     反应体系: 20μL体系中含real- time master mix 11. 2μL,模板DNA 4μL (约200ng)。试剂盒含4个浓度标准,同时有内源参照,ddH2O为模板作为空白对照。

     PCR反应条件: 50°C,2min; 95°C,10min;后40个循环为94°C,15s; 60°C,1min。

     ③计算方法。根据已知标准样品∧Cq值与转基因含量的对数值(log% GM)得出标准曲线及回归方程,把未知样品∧Cq值代人回归方程,得到未知样品的转基因含量。