TaqMan荧光探针法

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TaqMan荧光探针法

    20世纪90年代,美国Perkin Elmer(PE)公司开发出了TaqMan荧光探针定量技术,TaqMan探针的结构为:5′端标记有报告基因(Reporter,R),如FAM(6-羧基荧光素)、VIC等;3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q),通常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)(见图1-1)。基于水解探针的原理,当探针完整时,R所发射的荧光定量被Q基团吸收,不会检测到荧光,但当R与Q分开时,如利用合适的DNA的5′-3′核酸外切酶(常用Taq酶)活性,R基团的荧光可以被荧光检测系统检测到。因此,当溶液中有PCR模板时,该探针与模板退火。即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的FRET,发出荧光(见图1-2)。并且每扩增一条DNA链,就对应有一个R基团荧光信号,保证了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步,因此,对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程,准确定量PCR的起始拷贝数。

    常规TaqMan探针在使用中的问题在于荧光本底偏高,这是因为实际上探针设计时在保证Tm较高的情况下有时具有较长的碱基数,使得两端基团距离较远,会导致荧光淬灭不彻底,而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光,都会使得本底偏高。

荧光阈值

荧光阈值

    探针保持完整状态时,R所发射的荧光能量被Q基团吸收,不会检测到荧光。在PCR延伸的过程中,探针被5′-3′核算外切酶特异性地切割并释放5′端的荧光基团,发出荧光信号,荧光量与产物中双链的量呈正相关。

TaqMan MGB荧光探针法

    针对常规TaqMan探针荧光猝灭不彻底等造成的本底荧光值较高的问题,2000年美国Applied Biosystems公司开发了一种新的TaqMan 探针一MGB ( minorgroove binder oli-godeoxynucleotide conjugate, MGB-ODN)探针。这种荧光探针与常规TaqMan探针相比,有两个主要的不同:一.是探针3'端标记了自身不发光的猝灭荧光分子,以取代常规可发光的TAMRA荧光标记,这使荧光本底降低,荧光光谱分辨率得以大大改善;二是探针3’端另结合了MGB (minor groove binder)结合物,使得较短的探针可以获得较高的Tm值,大大增加了探针的杂交稳定性,使结果更精确,分辨率更高。鉴于TaqMan MGB探针的上述优势,现在多用于一些较为特殊和复杂的实时荧光定量PCR实验,如区分仅有单个核苷酸差异的等位基因的表达水平,微小RNA ( microRNA)定量检测等。

    MGB探针的缺点在于探针设计有一定的难度,一般需要委托专业的公司进行设计并验证效果,探针的合成和双荧光标记成本较高。

    综合比较以SYBRGreenI为代表的染料法和以TaqMan为代表的探针法,在实时荧光定量PCR的适用过程中各有优劣,前者的优势在于:对DNA模板没有选择性,适用于任何DNA;使用方便,不必设计复杂的探针,引物设计相对容易;比较灵敏,价格便宜。缺点为容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性。但可以通过熔解曲线的分析,优化反应条件,前提是对引物特异性要求较高。后者的优势在于:一旦有合适的引物和探针后灵敏度较高,对目标序列具有高特异性,可分辨单个碱基的突变,重复性比较好。缺点在于每次探针和引物的设计只适合一个特定的目标,而且大多需要委托公司进行设计和标记,价格相对较高,而且并不是针对每条靶基因均能找到本底较低的探针。