免疫共沉淀(Co-IP实验)技术服务常见问题解析

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Co-IP技术服务常见问题解析 QQ技术支持

本文对免疫共沉淀(Co-IP)实验中常见的问题进行汇总分析,并附有针对性的解决方案

1、免疫共沉淀(Co-IP)实验目的蛋白高背景产生的原因及处理方法?

目的蛋白高背景产生的原因有很多种,比如:
(2)有非特异性蛋白结合
(2)转移膜上的非特异性吸附
针对有非特异性蛋白结合这种情况,我们可以在无血清培养液中裂解细胞,而对于转移摸上的非特异性吸附,我们就要注意实验的操作问题,一定要戴手套,用镊子夹取,以及不接触转移膜转移面。

2、免疫共沉淀(Co-IP)实验失败的原因及处理方法。

答:(1)样品被蛋白酶降解,应对措施:裂解样品中加入蛋白酶抑制剂,注意冰上操作,避免反复冻融;
(2)抗体浓度太低,应对措施:调整抗体浓度,必要时设立浓度梯度,摸索最佳浓度;
(3)抗体亲和力低,应对措施:先用合适的抗体;
(4)IP抗体未与agarose珠子结合,应对措施:选用合适的agarose珠子,正确保存防止变质或干燥;
(5)Tag未暴露在融合蛋白构象的表面,应对措施:改变融合变大部位;
(6)裂解液严谨度太高,应对措施:改用低严谨度的裂解液。

3、免疫共沉淀(Co-IP)实验成败的关键在哪里?

答:实验最需要注意点就是抗体的性质。尤其是多抗的特异性是问题;
为防止蛋白的分解、修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验;
考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释;
确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

4、免疫共沉淀(Co-IP)中抗体怎么选择?

多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物)
抗体抗原信号强度 极佳 由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱) 极佳
特异性 通常很好,但有时会有非特异性相互作用 极佳,但有时会有交叉反应 极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)
优点 亲和力高(由于抗体可以与目的蛋白的多个抗原决定簇相互作用) 特异性好,且可以无限量供应 特异性好,亲和力高(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)
缺点 非特异性相互作用很难去除 需要筛选亲和力高的抗体;抗原表位可能会被相互作用蛋白遮蔽 能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多,所以单克隆抗体群也就不容易获得
免疫沉淀效果 极佳(由于亲和力高) 由抗体的亲和力决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)
免疫共沉淀效果 通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 有抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)
染色质免疫沉淀效果 通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交联实验所破坏决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

5、Co-IP实验中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱?

答:裂解液中去垢剂浓度过高或者配方太强烈;
蛋白和蛋白之间的相互作用太弱或不稳定。

6、IP 和 CoIP有什么区别?

答:IP是在已知一种蛋白质的抗体情况下,直接用这种抗体将目标蛋白质提取出来,是一种提纯蛋白质的方法。
免疫共沉淀(Co-IP)实验主要用于检测蛋白质与蛋白质之间连接作用,如你想检测蛋白质A与蛋白质B之间是否有相互作用,你手中又有蛋白质A的特异抗体,就将蛋白质A和抗体加入到含有蛋白质B的细胞解液中去,利用抗体提纯,如果蛋白质A,B之间有相互作用,则最后提纯产物是抗体——蛋白质A——蛋白质B。由于最后终产物是多种蛋白质复合物,所以这种技术叫做co-immunoprecipitation,和IP的用途区别还是很大的。

7、免疫共沉淀(Co-IP)实验如何避免假阳性?

答:若抗体浓度过高,则降低抗体浓度;若抗体特异性不好,则更换抗体。

8、实验对照的设置:

答:样品的阳性对照(input),抗体的阴性对照(同一种属的IgG)