1、淘选

采用A蛋白，分别对两款随机肽库：Ph.D.-C7C 噬菌体展示肽库试剂盒 （环化多肽）和Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒进行筛选，获得1-5个阳性克隆。

表1 Ph.D.-C7C噬菌体淘选出入库数据

Round	Conditions	Input	Output	Enriching factor
1st-P	Target protein: A (0.05 mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的 0.2M Glycine-HCl（pH2.2）1 mg/mL BSA，15 min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	2.0×106	5.0×104
2nd-P	Target protein: A (0.01 mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的 0.2 M Glycine-HCl（pH2.2）1 mg/mL BSA，15 min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	1.5×107	6.7×103
3rd-P	Target protein:A (0.01 mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的0.2 M Glycine-HCl（pH2.2）1 mg/mL BSA，15 min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	6.0×107	1.7×103

表2 Ph.D.-12噬菌体淘选出入库数据

Round	Conditions	Input	Output	Enriching factor
1st-P	Target protein: A (0.05mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的 0.2 M Glycine-HCl（pH2.2）1mg/mL BSA，15min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	5.0×105	2.0×105
2nd-P	Target protein: A (0.01 mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的0.2 M Glycine-HCl（pH2.2）1 mg/mL BSA，15min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	5.1×106	2.0×104
3rd-P	Target protein:A (0.01 mg/mL每孔150 μL) Blocking: 300 μL Blocking buffer 4℃, 1h TBST洗涤6次（Tween使用浓度为0.1%），入库 Washing: TBST, 10 times（Tween使用浓度为0.1%） Elution: 100 μL的 0.2M Glycine-HCl（pH2.2）1 mg/mL BSA，15 min 中和：15 μL的1M Tris-HCl，pH9.1	1.0×1011	1.2×107	8.3×103

2 Phage ELISA鉴定

2.1 Phage上清的制备

1)1：100稀释过夜培养的ER2738，每支1 mL分装到离心管中。
2)挑取单克隆到离心管中。
备注：平板上的噬菌斑不能超过3天，且存放于4℃，每个平板上的单克隆不高于100个，以确保挑取到的为单克隆。
3)37℃，220 rpm培养4.5-5 h。
备注：培养时间不要超过5 h。
4)14000 rpm离心30 s，取上清到新的离心管中；离心14000 rpm离心30 s，取80%的上清到新的离心管中，即为Phage上清。

2.2 Phage ELISA检测

1)包被：包被A蛋白，0.1 μg/mL，包被，4℃过夜。
2)封闭：2%脱脂奶粉封闭，200 μL/孔，37℃1 h。
3)一抗：Phage上清，100 μL/孔，37℃1 h。
4)二抗：anti-M13 antibody（HRP），1:20000，100 μL孔，37℃1 h。
5)显色：显色液100 μL/孔，37℃，15min。
6)终止：终止液100 μL/孔。
7)读板：Antibody titer。

2.3 Phage ELISA检测结果

挑取文库Ph.D.-C7C筛选获得的11个阳性克隆，进行单链DNA抽提和测序；

挑取文库Ph.D.-12筛选获得的8个阳性克隆，进行单链DNA抽提和测序。

3 单链DNA抽提和测序

3.1 单链DNA抽提和测序

1)1：100稀释过夜培养的ER2738，每支1 mL分装到离心管中。
2)挑取单克隆到离心管中。
平板上的噬菌斑不能超过3天，且存放于4℃，每个平板上的单克隆不高于100个，以确保挑取到的为单克隆。
3)37℃，220 rpm培养4.5-5 h。
备注：培养时间不要超过5 h。
4)14000 rpm离心30 s，取上清到新的离心管中；离心14000 rpm离心30 s，吸取500 μL上清到新的离心管中。
5)加入200 μL的20%PEG/2.5 M NaCl，上下颠倒混匀，室温静置20 min。
6)4℃、14000 rpm离心10 min，弃上清。（可能看不到噬菌体沉淀）
7)瞬时离心，弃尽上清。
8)加入100 μL的Iodide Buffer，重悬混匀。加入250 μL的乙醇，室温孵育20 min。
备注：短时间的室温孵育，可以有效沉淀单链噬菌体DNA，让大多数的噬菌体蛋白保留在溶液中。
9)4℃、14000 rpm离心10 min，弃上清。0.5 mL的70%的冰乙醇清洗两遍，4℃、14000 rpm离心10 min，弃尽上清。干燥3-5 min。
10)30 μL的TE重悬，-20℃保存。
11)采用96 sequencing primer，对单链DNA进行测序验证。

3.2 测序结果

共对筛选获得的17个阳性克隆的单链DNA进行测序分析，2个测序双峰（Ph.D.-C7C—2和Ph.D.-12-17），测序成功15个。其中，测序成功的15条序列中，符合筛选要求的多肽结果有15个，unique sequence，结果如下（图式省略）：

图1 测序结果分析

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