蛋白A或蛋白G柱纯化抗体

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>单克隆抗体定制开发>>蛋白A或蛋白G柱纯化抗体
服务概述

一、概述

蛋白A或蛋白G是细菌胞壁蛋白,它们能结合抗体Fc段。这一结合非常牢固,但其亲和力对pH的变化敏感,抗体/蛋白A或蛋白G的亲和力随pH值的降低而急剧降低。蛋白A或蛋白G亲和柱纯化抗体就是基于这种原理。

许多商家提供一系列共价偶联有蛋白 A和蛋白G的树脂。就大部分纯化操作而言,许多商家提供一系列共价偶联有蛋白 A和蛋白G的树脂。就大部分纯化操作而言,偶联的琼脂糖或聚丙烯酰胺微球是最佳选择。因为这些材料有良好的化学稳定性,能很好地承受色谱柱的物理压力,且价格相对低廉。操作时,先将蛋白A或蛋白G微球装柱,然后将粗制抗体在偏碱pH值情况下过柱。抗体在柱中和蛋白A或蛋白G结合,然后洗柱,用酸性缓冲液将抗体洗脱,再将洗脱液的pH调至中性,其中的抗体就可以备用。这种方法快速安全简单。

需要考虑的主要问题是对蛋白A或蛋白G的选择(见下表),它们对不同类型抗体的结合能力存在差异。通常建议用蛋白A纯化IgG2a、IgG2b和IgG3等亚类鼠源单抗,而用蛋白G纯化IgG1。对于其他种系来源的单抗,建议用蛋白G。对于多抗而言,兔、人、马、驴、猿、豚鼠、狗和牛等动物的样本应用蛋白A,而对于小鼠,大鼠以及山羊等动物的多抗,建议用蛋白G。

对蛋白A或蛋白G的选择
抗体来源 蛋白A 蛋白G
单抗
小鼠IgG1
小鼠IgG2a IgG2b,IgG3
大鼠
多抗
小鼠
大鼠
山羊
地鼠

二、实验相关

1、所需试剂和特殊设备

1.0mol/L Tris(pH8.0);100mmol/L Tris(pH8.0);10mmol/L Tris(pH8.0); 50mmol/L甘氨酸(pH3.0);简单的柱状色谱仪。

2、操作步骤

(1)加入1/10体积的1.0mol/L Tris (pH8.0), 调含抗体样品(血清,组织培养上 清液或腹水)的pH值至8.0。

(2)将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中,每毫升的湿微球能结合大约10~20ml抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗0体)。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。

(3)用10倍柱体积的100mmol/LTris (pH8.0)洗涤微球。

(4)用10倍柱体积的10mmol/LTris (pH8.0)洗涤微球。

(5)用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱,每次加入约1/2柱体积的缓冲液,分次加入。用含1/10柱体积的1mol/LTris (pH8.0) 的试管收集洗脱液,将各管缓慢摇匀,使其pH值恢复至中性。

(6)测定各收集管的280nm光密度,以得到蛋白含量(1OD约相当于0.75mg/ ml免疫球蛋白)。或用布氏染色结合斑点实验测定蛋白含量。将含抗体的收集管混合,并取2μg,用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。纯化的样品应有清晰的轻、重链带。

血清大约含10mg/ml 总IgG,组织培养上清液含20~ 50ug/ml单抗,而腹水含1~10mg/ ml。同所有蛋白溶液一样,应避免过度机械作用或接触空气,以便使蛋白变性降低到最低程度。

3、常见问题

用蛋白A或蛋白G柱常遇到的问题是个别来源的抗体不能很好的结合到树脂上。此种情况建议提高结合和洗涤使用的缓冲液盐浓度。蛋白A或蛋白G与抗体的Fc段的相互作用主要是通过疏水作用,加入高浓度盐有助于它们的相互作用而增加结合力,氯化钠浓度高达3. 3mol/L也起作用。

收集的抗体可能被低pH值的洗脱液破坏。不同种属或不同亚类的抗体应以不同pH值的酸性溶液洗脱。上述方法用pH值相同的洗脱液,除了少数情况外,还是可行的。然而,亦可使用pH值不太低的酸性洗脱液。可用同一试剂逐渐降低其pH值,以决定洗脱目的抗体所需的最温和条件。在分析研究中,用同一亲和柱纯化2种或2种以上抗体时应非常小心,因为不同的抗体与蛋白A或蛋白G的亲合力不同,这样很容易使某种抗体被亲和柱中残余的抗体污染。至于大样品纯化,建议对于相同来源的抗体使用固定的亲和柱。亲和柱应在4°C下存于硫柳汞中,需要时才取用。如果需要用同一亲和柱纯化多种来源的抗体,依次用2mol/L尿素、1mol/L 氯化锂和100mmol/L的甘氨酸(pH2.5)洗涤亲和柱,将能满足一般的纯化需要。

您可能对以下内容感兴趣:
    重组抗体表达技术服务    多克隆抗体制备服务    小分子抗原制备及偶联服务