利用抗原柱纯化抗体

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服务概述

一、概述

免疫亲和纯化技术常用于从多克隆抗体样本中纯化抗原特异性抗体。在这个过程中,纯抗原共价结合于固相支持物上,多克隆混合抗体中的那些对该抗原特异的抗体能和它结合。经过冲洗,将未结合的抗体除去,然后再将特异性抗体洗脱。这种方法不适用于单抗,因为它们与抗原结合的活性相同。

免疫亲和纯化技术常用于下面两种情况。第一种情况是抗肽抗体的制备。在制备抗肽抗体的过程中,要将抗肽抗体所针对的合成肽结合到载体蛋白上,以产生有效的免疫原性。针对肽载体复合物的多克隆抗体产生后,通常并不能直接使用,而要从血清的大量混合抗体中分离出特异识别该肽段的抗体。免疫亲和纯化技术能达到两个目的,一是将所需的抗体从针对载体蛋白的抗体中分离出来;二是浓缩特异性的抗肽抗体,提高其相对浓度。

免疫亲和纯化抗体技术应用的第二种情况是用于多克隆抗体制备,目的是去除不需要的抗体。特异及非特异的背景问题通常在用多抗时更为严重。去除非特异抗体的方法之一是用抗原柱纯化所需抗体。这一方法能大大减少干扰免疫化学检测结果的非特异性抗体。虽然有点麻烦,但能将低劣的抗血清变为有价值的试剂。

二、实验相关

1、所需试剂和特殊设备

100mmol/L甘氨酸(pH7.5).1mol/L Tris (pH8.0)
0.5mol/L磷酸钠(pH7.5)100mmol/L氨基乙醇(pH7.5)
1mol/L NaCl, 0.05mol/L磷酸钠(pH7.5)PBS10mmol/L Tris (pH7.5)
100mmol/L三乙胺(pH11.5,新鲜配制)500mmol/L NaCl,10mmol/L Tris (pH7.5)
10 mmol/L Tris(pH 8.8)

2、操作步骤

(1)将抗原共价结合到固相支持物上最简单的方法,是将抗原结合到活化的微球上。现有商家提供各种不同的支持物。这些活化的基质的应用将于第九章讨论。如果必须使用这些基质,首先推荐使用有弹性空间臂的基质。它能保证结合抗原的活性位点与微球自身之间合适的距离。如果使用多肽抗原,应将抗原直接连接到活化微球上。如果使用多肽抗原,最好将其直接连接到微球上,而不是将它先连接到一载体分子上。

如果合成肽在其一端有自由氨基或羧基基团,最好通过此基团将肽直接连接到微球上。

在个别情况下,合成肽不具有这些基团,这种肽应通过与制备抗原相同的方式将它们连接到载体分子上。这些载体分子必须不同于那些用于免疫的载体分子(例如可以用BSA -肽纯化针对KLH -肽产生的抗体)。否则,针对载体分子的抗体也将被纯化。尽管任何分子在理论上都能用作载体,但建议纯化抗体时的载体选用与制备抗体时使用的载体类似的大分子蛋白质。抗体样本的缓冲液中不能有外源性的化合物,它们能与活化微球的反应基团结合。最常见的结合过程是针对抗体上的氨基基团(或巯基,如果用氣化甲苯磺酰)。如果在抗体纯化时已用过这些化合物,抗体样本应用0.5mol/L磷酸钠结合缓冲液(pH7.5)充分透析。

(2)用0.5mol/L的磷酸钠溶液(pH7.5)制备抗原溶液。留小量样品以检测结合率(将在第5步中进行)。待结合的抗原量依不同的实验而异。在多数情况下,10mg的抗原加到1ml的微球上将得到高容量柱。同所有蛋白质溶液一样,应避免过度的机械作用或与空气接触,以尽量避免蛋白变性。

(3)加入根据厂家推荐的方法准备好的活化微球。

(4)用摇床在室温下轻柔混匀2 h或4C过夜。

(5)用0.5mol/L 磷酸钠溶液(pH7.5)洗涤微球2次,收集过夜结合的上清液。比较缓冲液中前后蛋白的含量。如果抗原有酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸残基,可比较其280nm处的吸光度值。也可用考马斯亮蓝染SDS-PAGE后的条带。

(6)用1mol/L氯化钠溶液和0.05mol/L磷酸钠溶液(pH7.5)洗涤微球一次。

(7)加入10倍体积的100mol/L乙醇胺(pH7.5), 室温下孵育4h或4 C过夜,轻轻摇匀。

(8)PBS洗2次。

(9)将结合有抗原的微球装柱。有些结合的抗原可能在洗脱抗体时亦被洗脱,预洗涤时,去除这些抗原非常重要。在本例中,抗体即能在低pH值,又能在高pH值时释放出来,所以要用这些缓冲液对抗原柱进行预洗涤。先用10倍微球体积的10mmol/L Tris (pH7.5) 溶液洗柱,再用10倍微球体积的100mmol/L甘氨酸(pH2.5) 洗涤,然后用10倍体积的10mmol/L Tris (pH8.8) 洗脱。检测最后出柱的Tris洗液的pH值。如果不是8.8,继续洗涤。接着加入10倍体积100mmol/L三乙胺(pH11.5, 新鲜配制)。用10mmol/LTris洗涤直至洗液的pH值达到7.5为止。

(10)将多克隆血清过柱,使抗体与柱上的抗原结合。血清上柱前应无任何沉淀,如果有,应通过离心或用蛋白A或蛋白G色谱柱(见前)纯化抗体,以便除去沉淀。如果样品是血清,上柱前用10mmol/L Tris (pH7.5) 将血清以1:10稀释。抗体溶液过柱时应用蠕动泵使其以低流速过柱。

使用高pH和低pH溶液洗脱,只能洗脱出一部分结合到柱上的抗体。一些高亲合力抗体在这些条件下仍不能被洗脱,因此最终将导致抗体结合容量降低。如果遇到这种情况,又不能得到新层析柱,可以用更苛刻的试剂洗脱,如1. 5mol/L硫氰酸钾、4mo!/L 尿素或3. 5mol/L氯化镁,它们可能使层析柱再生,用来制备有用的抗体,但取决于抗体的性质。

(11)用20倍微球体积的10mmol/L Tris (pH7.5) 洗涤柱,然后用20倍体积的500mmol/L氣化钠,10mmol/L Tris (pH7.5) 依次洗脱。

(12)通过用10倍体积100 mmol/L甘氨酸溶液(pH2.5) 过柱,可以洗脱对酸敏感的抗体。将洗脱液收集在盛有1倍微球体积的1mol/L Tris溶液(pH8.0)中。

(13)用10mmol/L Tris (pH8.0) 洗涤柱,直至pH值升至8.8。

(14)通过用10倍体积100 mmol/L三乙胺溶液(pH11.5, 新鲜配制)过柱,可以洗脱对碱敏感的抗体。将洗脱液收集在盛有1倍微球体积的1mol/L Tris溶液(pH8.0)中。

(15)用10mmol/LTris (pH7.5) 洗涤柱,直至其pH为7.5。将柱子存放于含0.01%柳硫汞的缓冲液中,以便以后重新使用。

(16)将各抗体溶液混合,并用含0.02%氯化钠的PBS溶液透析。如果有必要,可通过蛋白A或蛋白G柱浓缩抗体(见前)。

3、常见问题

这一方法的主要优势是能将特异性抗体从多种抗体的混合样本中分离出来。它的最大的缺点是需要大量的抗原,而且特异性抗体所需的洗脱条件可能导致抗体活性的部分丧失。

如果可用的抗原量很少,用免疫亲和纯化技术纯化所需抗体就不合适。这种情况可以考虑用免疫印迹转移到硝化纤维膜上的抗原来纯化抗体,虽然这一方法纯化的抗体量有限,但作为分析研究用已足够。

如果抗体不能稳定地从柱上洗脱,或洗脱下来的抗体不再结合抗原,应试用其他的洗脱条件。第九章详细讨论了免疫亲和纯化技术,这种方法可用于分离抗原。这两种亲和纯化技术的原理是一样的,第九章介绍的洗脱条件在这里也可以试用。

有时少量的抗原能从抗原柱上洗脱。如果在某些检测中,那些用亲和纯化获取的抗体对抗原的污染敏感(如涉及酶活性的检测),就必须检测每份抗体洗 脱液中是否有抗原存在。

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