噬菌体展示

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噬菌体展示技术创立于上个世纪八十年代后期,被誉为抗体第三次革命中的革命,从此用丝状噬菌体表面展示技术制备高亲和力特异性抗体成为可能。表面展示系统除丝状噬菌体展示系统外,还包括λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和细菌展示系统。

噬菌体展示技术的原理

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,是外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。通俗一点来讲,就是将抗体的基因插入到噬菌体中,导致噬菌体的表面能够“展示”抗体,就像用鱼钩钓鱼一样,这种技术能用噬菌体把有用的抗体钓出来。

噬菌体展示原理

噬菌体技术与杂交瘤技术制备单抗的比较

杂交瘤技术 噬菌体技术
开发周期 4-6月 2-2.5月
成功率 <70% >90%
动物使用
抗体类型 鼠抗体 鼠抗体或成人抗体
抗体特异性 不可控 可定向筛选
抗体优化 可方便进行亲和力成熟
抗体基因 可直接提供抗体DNA序列,便于进行基因工程改造

噬菌体展示系统

单链丝状噬菌体展示系统

1.pIII展示系统
  丝状噬菌体是单链DNA病毒,pIII是病毒的次要外围蛋白,位于病毒颗粒的一端,每个病毒颗粒都有3—5个拷贝pIII蛋白,pIII有两个位点可供外源序列插进,即N端和近N端可伸屈胃内。当抗体片断或蛋白质融合到PIII的N端时,噬菌体仍有感染性,但若融合到后一位点则会切往N端而丧失感染性,这时就需有辅助噬菌体提供野生型pIII蛋白。PIII很轻易为蛋白水解酶水解。所以有辅助噬菌体超感染时.可以使每个噬菌体均匀显示不到一个融合蛋白,即所谓“单价”噬茵体,从而使抗体部分最大限度地保持原构型而功能完好。
  pIII展示系统的主要用途是制备噬菌体抗体,它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。自然免疫系统中.抗原结合于B细胞表面受体而使其活化并分裂增殖、分化成有抗体分泌功能的浆细胞。这个过程可以从约5×109个鼠细胞选出一个至几个特异B细胞,并有选择性地富集特异性B细胞,通过多轮突变和选择使抗体亲和力成熟。pIII展示系统完全模拟了自然选择系统;噬菌体展示的抗体片断可以由抗原包被的板、柱等选择,或者用生物素标记的抗原从液相中捕捉。结合在固相抗原的噬茵体抗体经洗涤后可用可溶性半抗原、酸、碱等洗脱,然后感染大肠杆菌培养扩增,再经下一轮的“吸附—洗脱—扩增”筛选。首轮筛选可使特异性噬菌体富集20一1000倍,一般经4轮筛选,可富集107倍。对初步筛选的抗体,可以用错构酶及PCR锗配技术等实行多轮突变或采用链置换法使其亲和力成熟。
  与杂交瘤技术相比,pIII展示系统筛选范围从几千扩增到几百万甚至几亿.而时间可以从几个月缩短到几周,它不但绕过了繁琐的杂交瘤技术.甚至可以绕过免疫,而且可以直接获取人源性抗体,解决了鼠单抗应用于人体免疫源性的问题。

2.pVIII及其它展示系统
  pVIII是丝状噬茵体主要衣壳蛋白(major Coat protein),每个病毒颗粒有3000拷贝pVIII蛋白。pVIII的N端四周可融合五或六肽,但不能融合更长的肽链,由于较大的多聚蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失往感染力。但有辅助噬茵体参与时,可提供野生型pVIII蛋白.降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段

pIII和pVIII系统的比较

pIII系统 pVIII系统
拷贝数
多肽片段大小 <10个氨基酸
亲和力
适用范围 常用于展示有cDNA和基因组序列编码的多肽,范围较广 展示小肽,范围较窄

λ噬茵体展示系统

1.pV展示系统
  λ噬菌体的主要尾部蛋白pV可供外源序列插进。λ噬菌体基因V编码的主要尾部蛋白形成管状结构,由32个盘状结构组成,每个盘状结构又由6个pV亚单位组成。pV有两个折叠区〔fo1ding domain),C真个折叠区是病毒的非功能区,可供外源序列插进或替换。Maruyama等用pV系统成功地展示了有活性的大分子蛋白:β—半乳糖苷酸(465KD)和植物外源凝集素BPA(120KD)。DNA结合蛋白、放多细胞质蛋白若融合进丝状噬菌体,将相互干扰由细菌细胞质到周质腔分泌的通道,而用λ噬菌体使其在细胞质中完成折叠,无需分泌,因此避免了这一干扰。λ噬菌体还可以展示难以分泌的肽或蛋白质,因此可作为丝状噬菌体展示系统的补充。

2.D蛋白展示系统
  D蛋白是λ噬菌体头部组装必须蛋白,分子量11KD。λ噬茵体颗粒的两个结构单位头部和尾部是分别组装的。在头部组装过程中先形成支架状前头,然后水解加工成前头,当DNA进人头部以后,D蛋白附着于病毒衣壳的外侧、将噬茵体头部锁住,使之围绕DNA就位,因此正常情况下,D蛋白在噬茵体头部形态发生上是必须的。但是当噬茵体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体。这种展示一般为N端展示。它的组装可以在体内,也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD—噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化进λD—溶源的E.Coli菌株中从而补偿溶源茵所缺的D蛋白,通过热诱导而被组装,或利用噬菌体P1的Cre—loxP定点重组系统将外源基因整合进进噬茵体基因组中。
  D蛋白展示系统的特点:由于是在病毒细胞内完成组装.无需将外源肽或蛋白分泌到细菌细胞膜,可以展示对细胞有毒性的蛋白。另外,D蛋白展示系统还可以用于cDNA文库的构建,抗原位点分析及作为基甲输送工具。Mikawa等对D蛋白的基因进行了改造,使外源序列在D蛋白的N端和C端都能插进,并成功地表面展示了有活性的葡萄球菌A蛋白IgG结合域、β—半乳糖昔酶和β—内酰胺酶。

T4噬茵体展示系统

  T4噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与T4噬菌体的小外衣壳蛋白(small outer capsid protein SOC)C端融合而被展示。如SOC是一个分子量为9KD的小蛋白,是T4衣壳组装非必须的,而且不论在体内还是体外,它都具有与成熟衣壳表面特定位点高亲和力地专一结合的能力,T4噬菌体是在宿主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此可以展示的败或蛋白质范围广,尤其适用于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质。
  目前已成功地利用该系统展示了HIV—1病毒被膜糖蛋白gpl 20的v3环状结构域和脊髓灰质炎病毒VPl衣完蛋白(312肽),两者均能形成正确的折叠结构。由于该系统容量大(至少35KD的蛋白质)、拷贝数高,故在完整结构域或蛋白质的免疫学展示、蛋白质与蛋白质问相互作用的研究及生物工程学方面有相当大的应用潜力。
  现在有研究报道利用E.coli的脂蛋白、鞭毛蛋白展示外源蛋白。但是相对而言,革兰氏阳性菌比阴性的有优越性:G 细菌表面受体比G—细菌更易接受外源序列的插进;G—细菌展示系统的表面展示要穿过整个细胞质膜,需要膜上的正确整合过程,而G 细菌展示系统只需穿过单层膜就可以实现理想的展示;以细菌全细胞作为诊断或Panning实验,从巨大文库中筛选特异性细菌克隆的实际操纵中,由于G 细菌有较厚的细胞壁,不轻易在各种实验过程中发生细胞溶解。

T7噬茵体展示系统

  T7 噬菌体基因组为线性双链DNA,其衣壳蛋白通常有两种形式,即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基),10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面,所以被用来构建噬菌体展示系统。T7噬菌体展示系统可以高拷贝展示50个氨基酸的多肽,以低拷贝量(0.1-1/噬菌体)或以中拷贝量(5-15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质。因此,广泛应用于筛选不同分子量,不同亲和力的蛋白质。

T7噬菌体展示

优点及缺点

优点 缺点
1.高通量筛选
2.高效率
3.可用于模拟表位的筛选
4.易于纯化
5.分析序列快速简便
1.肽库容量有限
2.体内筛选时需外加选择压力
3.肽库的多样性需要解决
4.依赖于细胞内基因的表达

噬菌体展示

  噬菌体展示技术就是将天然免疫和获得性免疫个体中分离的抗体基因插进噬菌体DNA中。抗体分子包括抗体的可变区域,该区域能与抗原结合,称作scFv,被连接到噬菌体衣壳蛋白上。噬菌体感染大肠杆菌后,单链DNA在宿主内复制,并且噬菌体重新组装,分泌到培养基中去,同时不会裂解宿主大肠杆菌。噬菌体与靶标抗原孵育,结合上去的噬菌体分离后,扩增,纯化。这种方法能方便的筛选大量的克隆。