纳米抗体筛库案例

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  本项目为噬菌体展示纳米抗体文库的筛选案例,分为淘选、Phage ELISA筛选、Phage中和活性筛选、中和活性Soluble ELISA检测、进化树分析几步。


一、淘选

利用噬菌体展示A纳米抗体文库,针对A免疫抗原进行三轮体外定向筛选,结果如下所示。

Round Conditions Input Output Enriching factor
1st-P Target protein: A免疫抗原(5μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
  Neutralization: 1M Tris-HCl
1.13×1012 5.04×108 2.24×103
2nd-P Target protein: A免疫抗原(2μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
 Pre-counter select: 2% Milk
1.18×1012 7.92×108 1.49×103
2nd-N Target protein: No Coating
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk
1.08×1011 3.04×104 3.55×106
3rd-P Target protein: A免疫抗原(2μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST(预吸附)
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk
6.53×1011 7.77×109 0.84×102
3rd-N Target protein: No Coating
Blocking: 2% Milk-PBST(预吸附)
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk
6.53×1011 3.5×106 1.87×105

二、Phage ELISA筛选

1.Phage上清的制备

(1)分别从第一轮和第二轮出库的平板上个挑取2板(94*2)个单克隆菌落至1ml的2×YT-AI-hp培养基中,37℃,200rpm摇菌过夜。

(2)5000 rpm,10min离心。小心吸取上清600 μl分装到1.5ml离心管,即为phage ELISA待测样品。

2.Phage ELISA检测

(1)包被:A,0.1μg/ml,包被,4℃ 过夜。

(2)封闭:2%脱脂奶粉封闭,200μL/孔,37℃1h。

(3)一抗:样品,10倍稀释,100ul/孔,37℃1h。

(4)二抗:Mouse anti HA tag mAb.1:10000,100μL/孔. 37℃1h。

(5)HRP:HRP conjugated Goat anti-Mouse IgG pAb 1:20000.100μL/孔. 37℃1h。

(6)显色:显色液.100ul/孔. 37℃.15min。

(7)终止:终止液.100ul/孔。

(8)读板:Antibody titer。

3.Phage ELISA检测结果

第一轮出库单克隆:

第二轮出库单克隆:

三、Phage中和活性筛选

分别挑取第一轮panning的43个阳性单克隆和第二轮panning的126个阳性单克隆Phage上清,进行中和活性检测。挑取的样品如下:


1.中和活性检测

(1)包被:A抗原, Recombinant,0.1μg/ml,100μL/孔,过夜。

(2)封闭:2%脱脂奶粉封闭,200 μL/孔,37℃1h。

(3)一抗:phage样品(一、二筛大于2),10倍稀释,100 μL/孔,37℃1h , PBS作为对照 。

(4)受体:A, Recombinant (His Tag), Biotinylated,0.1 μg/ml 100 μL/孔,37℃1h。

(5)二抗:SA-HRP(钟鼎抗体部内部产品),1:10000,100 μL/孔, 37℃1h。

(6)显色:100 μL/孔,37℃,15min。

(7)终止:100 μL/孔。

(8)读板:Antibody titer。

2.中和活性检测结果

挑取数值最低的30株(红色加亮),即中和活性最好的30株,安排测序。共获得7个unique sequence的克隆。

四.中和活性Soluble ELISA检测

1.周质腔可溶性蛋白制备

  将上述7个unique克隆(in E.coli TG1),在37°C进行IPTG诱导表达,离心后收集菌体,进行周质腔可溶性蛋白抽提。

(1)从每管单克隆菌液吸取10 μL加入到1 mL 2×YT-AG(氨苄100 µg.ml-1和葡萄糖2%),37℃,200 rpm过夜。

(2)取0.4 ml过夜培养的单克隆菌液到20 ml的2xYT-AG(葡萄糖0.1%)中,37℃,220 rpm,培养约2.5 h,至对数生长期。

(3)3000 rpm离心15 min弃上清。加入20ml的2×YT-AI(IPTG终浓度为1mM),30°C,200 rpm过夜。

(4)3000 rpm,离心15 min,丢弃上清,用0.5 ml 预冷1×TES重悬沉淀,冰上放置15 min,再加入 0.75 ml 预冷 1/5 × TES,充分混匀。冰上放置30 min。

(5)13,000 rpm ,4 °C,10 min离心,小心吸取上清转移到新的离心管,即为周质上清。

2.周质腔可溶性蛋白检测

  上清经10倍起始,5倍稀释后,共8个梯度,取100 μL分别对包被了A免疫抗原(0.1μg/ml/well)的ELISA wells进行检测,同时用非相关的含有hig-tag的蛋白、其他项目的Soluble上清(250倍稀释)和1×PBS做阴性对照。

(1)包被:A抗原 Recombinant,0.1μg/ml,100μL/孔,过夜。

封闭:2%脱脂奶粉封闭,200μL/孔,37℃1h。

(3)一抗:Soluble样品,100μL/孔,37℃1h,PBS作为对照。

(4)受体:A (His Tag), Biotinylated,0.1μg/ml,100 μL/孔,37℃1h。

(5)二抗:SA-HRP(抗体部提供),1:10000,100 μL/孔,37℃1h。

(6)终止:100μ l/孔。

(7)读板:Antibody titer。

3.中和活性Soluble ELISA检测结果

根据ELISA结果,7个抗体均具有中和活性,达到项目预期。

五.进化树

对筛选获得的7个具有中和活性的抗体,进行进化树分析,结果如下:

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