硫酸铵沉淀法纯化抗体

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硫酸铵沉淀法纯化抗体原理

  蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当有中性盐加入蛋白质溶液时,中性盐对水的亲和力大于蛋白质,蛋白质分子周围的水化膜层减弱甚至消失,使蛋白分子的溶解度降低。同时,由于中性盐的加入,离子强度发生改变,蛋白表面的电荷被中和,更加导致蛋白分子的溶解度降低,蛋白分子之间聚集而沉淀。在盐浓度较低时,蛋白的溶解度随盐浓度的升高而增加,当盐浓度达到一定浓度时,蛋白的溶解度会随着盐浓度的升高而降低并先后溶解出来。硫酸铵沉淀法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不同而达到彼此分离的方法。

适用体系: 血清中抗体的纯化

主要实验方法:

·将待纯化的血清用生理盐水稀释;
·向稀释过的血清中加入一定饱和度的硫酸铵粉末,边加边搅拌,选择特定的硫酸钠浓度进行沉淀

硫酸铵浓度对照表
硫酸铵沉淀法纯化抗体

·4℃过夜沉淀或者沉淀至少8 h;
·将沉淀8 h的样品12000离心30 min,去上清;
·用PBS将沉淀溶解后PBS透析过夜,以去除残留的硫酸铵;
·将纯化获得的抗体溶液进行性质分析。

影响硫酸铵沉淀抗体的因素

蛋白质浓度
  蛋白质浓度对沉淀有双重影响,既可影响蛋白质沉淀极限,又可影响蛋白质的共沉作用,蛋白质浓度越高越易沉淀,但浓度过高,也容易引起其它蛋白质的共沉淀,从而影响纯化效果。因此,常常需要先将血清用生理盐水稀释后再盐析。

盐浓度
  不同的蛋白沉淀需要不用的离子强度,例如不同的硫酸铵饱和度,会使不同的蛋白析出。当饱和度达20%时,纤维蛋白原首先析出;饱和度达到28% ~ 33%时,优球蛋白析出;饱和度达到33% ~ 50%时,球蛋白析出;饱和度大于50%以上时,清蛋白析出。免疫球蛋白常在硫酸铵饱和度33%时开始析出

pH
  在等电点时,蛋白质溶解度最小,容易沉淀析出。因此,盐析时除个别特殊情况外,pH常选择在被分离的蛋白质等电点附近。

温度
  由于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保护作用,盐析操作一般可在室温下进行,血清蛋白质在25℃时较0℃更易析出,但对于温度敏感的蛋白,应该在低温下操作。