抗体制备实验常见问题解析

1、抗体纯化方法及纯化时应注意的问题有哪些？

答：抗体纯化时可采用分子筛层析、盐析法、离子交换亲和层析等方法。
抗体纯化时需要注意以下问题：
（1）尽可能避免引起免疫球蛋白聚合、变性。
（2）应验证所用的抗体纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其它热原质、培养液成分或层析柱析出成分等。
（3）应注意所用方法能有效去除/灭活病毒。
（4）连续产生的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。

2、单克隆抗体和多克隆抗体的有什么区别？

在做抗体制备前，首先根据实验的需求对单克隆抗体和多克隆抗体制备进行选择

	单克隆抗体	多克隆抗体
制备周期	长（5-6个月）	短（2-3个月）
技术要求	高	低
产量	高	低
价格	高	低
对免疫原要求	较高	高
特异性	高	高（抗原亲和纯化）
识别表位	一个	多个
非特异性结合	较少	较多
灵敏度	较高	高
标准化	易，批间差小	较难，批间差大
稳定性	较好	好
凝集反应	大多数没有	有
沉淀反应	大多数没有	有
中和活性	大多数没有	有

 

3、杂交瘤细胞应该如何保存？

答：目前单克隆抗体制备主要还是用杂交瘤细胞的方法，当获得生产所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移导致丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：
（1）材料：细胞：取对数生长期的细胞；20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml ；灭菌的2ml安瓶；10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器 ，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒，其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
（2）操作：a.去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640培养液，使细胞悬浮。b.1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞／ml。c.取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。d.用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。 e.放4℃ 2h。 f. 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。g. 转入液氮部分。

4、杂交瘤细胞复苏老是失败，该如何复苏？

答：（1）将杂交瘤细胞冷冻管从液氮中取出后立即进行38℃～42℃水浴
（2）待细胞悬液快速解冻后，将细胞用RPMI-1640液清洗两次，随后将细胞用完全RPMI-1640培养液配成细胞悬液滴入24孔培养板孔中或25ml培养瓶内，置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养。
（3）待复苏细胞生长良好时，进行2~3d传代培养。注意若冷冻后死亡细胞较多，可采用提前在培养板或培养瓶中加入饲养细胞。具体做法是在复苏冷冻细胞前一天，于24孔培养板每孔中加小鼠腹腔巨噬细胞0.5ml，104 /mL。

5、免疫佐剂的作用是什么？常见的佐剂有哪些？

答：抗体制备实验中，免疫佐剂作为抗原的承载物，可延缓抗原的清除，延长抗原在体内刺激免疫系统的时间，从而使抗体的产量增加。 常见的免疫佐剂可分为以下4类：无机佐剂、有机佐剂、油剂、合成佐剂，如铝盐佐剂、弗氏佐剂、免疫刺激复合物、脂质体和类病毒颗粒等。
其中最常见并且使用最广泛的免疫佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）和弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant，FIA）。FIA 是油剂与乳化剂的混合物，在其中加入灭活的分枝杆菌，即为FCA。
还有一种是新型水溶性快速免疫佐剂Quick Antibody。它的作用原理是病原体相关分子模式，主要是Toll 样受体配体和阳离子聚合物以激发胞质受体来识别病原体。有无毒、无需乳化、不破坏抗原的空间结构、使用前混匀后im 即可等优点。

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