悬浮培养杂交瘤细胞法制备单克隆抗体

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>抗体制备服务>>BMP单抗制备

  相信点进来看的朋友大多被BMP这个词整的一头雾水,百度一下好像也没有这方面的介绍。那么到底什么是BMP?这边也就不跟大家卖什么关子了,BMP其实就是Better Monoclonal antibody Production的简称,是通过悬浮培养杂交瘤细胞的方法来生产单克隆抗体,我们把它定义为更好地单克隆抗体生产方式,那么它到底好在哪里?下面就用一个案例来揭开它神秘的面纱。

案例背景

  以客户提供的3株杂交瘤细胞株(a,b,c)培养扩增,将细胞替换用无血清培养基做抗体表达,使用Protein G的方法优化纯化条件,获得纯化抗体,对抗体进行浓度、纯度鉴定。

细胞培养

1.细胞复苏

  确定需要复苏的细胞株存放在液氮罐内的位置,从液氮或-80℃冰箱内取出冻存的细胞,迅速放入37℃水浴锅内,不停摇晃,使其迅速溶解,复苏时间尽量控制在1 min左右,将细胞悬液加入事先准备好含4 mL培养基的15 mL无菌离心管内,1000 r/min,离心5 min,弃上清,重悬沉淀,转至T25 cm培养瓶继续培养;

2.细胞传代

  T25 cm培养瓶长至底部密度80%-90%,弃上清,轻轻拍打培养瓶两侧数次,观察细胞是否脱落,按1传3的比例进行扩大培养。

3.无血清细胞培养

  含血清培养的细胞状态调整到最佳时收取10×106个细胞悬浮至125 mL的细胞培养摇瓶中,稀释至20 mL 0.5×106个/mL;细胞状态不佳时需要添加一定量的补料,根据订单的要求将细胞扩增至一定的体积后开始表达。当细胞密度低于1×106个/mL,死亡率高于30%收货细胞上清用于抗体纯化。

纯化

(1)准备Protein G化柱,用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子。
(2)细胞上清以1 mL/min的速度上样至Protein G柱。
(3)用20 mM PB缓冲液以0.5 mL/min流速洗脱杂样,至流出液OD280值到达基线。
(4)洗脱在蛋白值至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱。
(5)用Elution-Buffer(0.1 M NaCl,0.1 M 甘氨酸,pH 3.0) 以1 mL/min流速洗脱目的抗体,收集流出液,并用pH9.0 Tris-HCl使其pH值恢复至中性,将收集的抗体溶液加入透析袋中,用20 mM PBS(pH7.4)透析过夜。
(6)透析后的样品进行SDS-PAGE纯度分析和BCA浓度检测。

纯化抗体SDS-PAGE(reduced)分析

抗体制备

纯化抗体a、b、c、SDS-PAGE(reduced)分析
Fig.1 SDS PAGE(reduced) analysis of 2G8 purified antibody
M:蛋白质分子质量标准
1: 纯化抗体a
2: 纯化抗体b
3: 纯化抗体c

  通过浓度和纯度检测得出,抗体纯度在85%以上。

  以上就是BMP的案例介绍,比起传统的腹水制备的方法,有着更高纯净度、更高特异性、更稳定、成本低等众多优势:

高纯净度

因为整个生产过程不需要血清不需要蛋白,而是通过悬浮培养杂交瘤细胞来进行单克隆抗体制备,因此通过BMP生产的抗体更纯净,没有传统腹水中会存在的小鼠lgG污染,也没有动物源和蛋白污染等问题;同时避免了因使用牛血清造成的动物源性病毒的污染风险

高纯净度

更高特异性

传统腹水中小鼠本底IgG及动物源性细胞培养中IgG会影响抗体的特异性,BMP方式生产抗体可避免IgG对抗体的影响,使获得的抗体拥有更高的特异性

单克隆抗体制备

更高效价

通过BMP生产所得的抗体,效价比传统腹水的效价高至少两倍。

更稳定

相较于传统腹水制备技术中因为小鼠间个体差异导致同一批次抗体质量参差不齐,BMP生产的抗体批次稳定性极高

更稳定


































成本更低

  不管是时间成本还是经济成本,BMP比以往的腹水制备方式都有更多的优势。时间上,腹水制备流程:细胞培养3-5天,石蜡预处理10-14天,腹水产生14-30天;BMP生产流程:细胞悬浮培养1周完成。产量上,BMP方式生产抗体,平均表达产量高达60mg/L。BMP方式更易标准化,更易规模化。

  终上所述,BMP相较于传统腹水单克隆抗体制备具有很大的优势,不管从哪个方面讲,选择BMP技术制备单克隆抗体都是一个非常明智的选择。