染色质免疫共沉淀(ChIP)实验流程与关键因素

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  染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一种检测在体内自然染色质环境下蛋白和DNA相互作用的有效方法。这种技术广泛应用于检测特定基因调节蛋白结合在基因组中的具体位置或者基因调节区域和蛋白的修饰是否相关。日益成为研究真核细胞中转录调控情况的重要工具。本文将会介绍ChIP的原理和实验流程以及实验成功的关键因素。

染色质免疫共沉淀实验流程

1.染色质免疫共沉淀实验流程 在线QQ技术支持

1.1.甲醛交联细胞

(1)细胞在100mm培养皿上生长到80% ~90%。当第一次使用细胞系做实验时,另外培养两个培养皿,一个用于预测细胞数量,另外一个用于优化超声条件。
(2)去除上清培养液,加入lOmL 1xPBS含有终浓度为1%甲醛(加入270μL 37%甲醛到10 mL PBS)固定交联细胞,轻柔混合后置于室温10 ~20 min。
(3)加入1 mL 1.25mol/L甘氨酸(终浓度为0.125 mol/L)终止交联反应,甘氨酸终止甲醛的固定作用是通过提供过量的氨基团与甲醛结合。继续放在室温5 min。
注意:从这一步开始,把所有东西放在冰上或者4℃,包括离心步骤。
(4)吸取走上清液后,用10 mL预冷1xPBS洗两遍后,以去除残留的甲醛。
(5)加入4 ~5mL预冷1xPBS,能足够覆盖培养皿的表面,再用细胞刮棒刮落细胞, 转移到50 ml锥形离心管,再用4~5 mL预冷1 xPBS冲洗培养皿以收集残留的细胞。
(6)4000 rpm 离心 5 min (4℃)。
(7)去除上清,用1 mL预冷1xPBS (新鲜加入1xPIC 1O μL)悬浮细胞后,转移到1.5 mL离心管。
(8)4000 rpm 离心5 min (4℃)得到细胞沉淀,去除上清(细胞沉淀可放于 -80 ℃冰箱保存)。

1.2.染色质超声断裂

(1) 加入1 mLSDS裂解溶液重悬沉淀(新鲜加入1 X PIC 1O μl,在冰上放置10 min,每隔1 min颠倒摇动离心管。SDS能裂解细胞膜和核膜,使固定染色质释放出来, 这样有利于超声。
(2) 用超声细胞粉碎机把DNA打碎为长度在200 ~ 1000 bp,把样品放在冰上操作。不同细胞样本都得进行超声条件优化实验。
(3) 在超声后,14000 rpm 离心 10 min(4℃),转移超声染色质液体上清到1.5 ml 离心管。上清液可放于-80℃冰箱保存。

1.3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物

(1)使用ChIP稀释溶液把超声染色质液体稀释10倍,这样有利于免疫沉淀反应。 例如200 μL超声染色质液体加入1800 μL ChIP稀释溶液(新鲜加入1 x PIC 20 μL)。
(2)为了减少非特异性结合蛋白背景,往2 mL超声稀释液中加入20 μL蛋白A/G琼脂糖珠(Protein A/G Agarose Beads),在4℃摇床轻柔摇动1 h。
(3)1000 rpm离心2 min (4℃),转移上清液到新的离心管,加入1〜4叫免疫沉淀抗体(每种抗体加入的量都不同)到上清液中,在4℃摇床轻柔摇动过夜。另外取 50 μL上清液,不加入抗体,作为阴性对照,以验证检测的特性。

1.4.收获免疫复合物(抗体-蛋白质-DNA)

(1) 40 μL Protein A/G Agarose Beads 先用 1 mL 1 x PBS 洗 3 遍,每次洗后 1 000 rpm 离心1 min,小心吸除上清,注意不要吸走Beads。最后加40 μL 1XPBS悬浮Beads。
(2)打开样品的管盖,加入40 μL Protein A/G Agarose Beads。在摇床上面摇动1~2 h,4℃,以形成抗体-蛋白A免疫复合物。
(3)1000 rpm离心5min,4℃。去除上清,注意不要吸走Beads。
(4)清洗Beads:免疫沉淀复合物依次用以下所列的缓冲液洗(每个1 mL)。每次洗时,使样品在摇床上面10min,4℃,然后再4000 rpm离心5 min。吸取上清时要注意不要吸走beads。
a.低盐洗脱溶液1 mL洗一次;
b.高盐洗脱溶液1 mL洗一次;
c.氯化锂洗脱溶液1 mL洗一次;
d.TE溶液(pH 8.0) 1 mL洗两次。

1.5.洗脱免疫复合物

注意:从这一步开始,所有操作都在室温进行。

(1)加入200 μL ChIP洗脱溶液洗脱Beads,放在摇床上室温摇动10 min。12000 rpm,离心1 min,把上清转移到新的1.5 mL离心管。
(2)再加入200 μL ChIP洗脱溶液洗脱Beads,放在摇床上室温摇动10 min,一共洗脱3次,得到600 μL洗脱液。洗脱液中含有目的蛋白以及其结合的相关DNA。

1.6.去除甲醛交联

(1)加入 24μL 5mol/L NaCl 到 600μL 样品中(NaCl 终浓度为 0.2mol/L),包括 上述1.3中的50 μL阴性对照(加入350μL ChIP洗脱溶液和16 μL 5mol/L NaCl)。
(2)65℃,过夜去除甲醛交联。甲醛能够在有盐离子和去污剂的高温环境下解除交联反应,使得蛋白质和DNA分离。

1.7.DNA 纯化

DNA纯化可以通过酚/氯仿抽提或者通过硅胶柱纯化。
酚/氯仿抽提
(1)对所有实验样本(600 μL)和50μL 阴性对照样本,分别加入 10μg RNase A, 在37℃放置30min,以去除RNA。然后加入50μg 蛋白酶K,在37℃放置1h。
(2)加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀,12000 rpm 离心5 min。
(3)小心吸取上清液到新的1.5 mL离心管,加入 1/10体积的3 mol/L 乙酸钠和2倍体积冰冻无水乙醇,顺时针混匀后,放在-80℃冰箱1h。
(4)12000 rpm 离心 20 min,4℃。
(5)小心去除上清,注意不要吸走DNA沉淀,然后再加入70%乙醇,悬浮沉淀,12000 rpm离心10min,去除上清,让DNA沉淀干燥。
(6)用40 μL TE溶解DNA沉淀。

1.8.染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定

(1)如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列,可以根据靶序列设计引物,用荧光定量PCR的方法,比较特异性和非特异性免疫抗体所沉淀的DNA的PCR产物的量,或者比较根据靶序列设计的引物和远离靶序列设计的引物的PCR产物的量。比值越大,则说明靶序列DNA与目的蛋白相结合的可能性越大。
(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因组的分布情况,找出转录因子的结合位点,可以采用ChIP克隆测序,DNA芯片(ChIP-chip)和ChIP-seq方法。
其中ChIP克隆测序实验过程如下:
1)用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase)使目的DNA的3'突出末端平滑化,5'突出末端补平,从而形成平滑末端。10 μL反应体系(1 μL 10 X T4 DNA聚合酶缓冲液,1 μL 1 mmol/L 的 dNTP,1 μL T4 DNA 聚合酶,7 μL DNA溶液),37 ℃ 1h。
2)往体系中加入1 μL 10 mmol/L的dATP, 1 U的 Taq聚合酶,72℃—个小时,使DNA的3'添加上A碱基。
3)建立连接反应:10 μL反应体系(1 μL 10XT4 DNA连接缓冲液,1 μL T4 DNA连接酶,7.5 μL步骤2)的反应产物,0.5 μL T载体),室温1h。
4)把连接产物加入到100 μL感受态细胞中,冰上30 min,42℃热激活90s,再放冰上2 min后,加入900 μL LB培养液37 ℃培养45 min,最后涂板到含有Amp的LB平板培养皿。
(3)第二天从平板上随机挑取克隆单菌落,摇菌6h后,抽提质粒。
(4)用限制性内切酶酶切质粒后,在1%琼脂糖胶电泳,而用空载体进行比较,从中选取插入片段大于500 bp的重组载体进行测序(小于500 bp的插入片段大多是非特异免疫沉淀的DNA)。
(5)对插入片段测序后,与GenBank中的数据进行比较(BLAST),寻找所测序列附近含有开发阅读框(ORF),该序列是转录因子结合的位置,对感兴趣的序列可做进一步的分析

2.染色质免疫共沉淀实验关键因素

2.1甲醛的固定交联程度

  甲醛能使蛋白质和DNA固定交联形成复合物,能够真实反映细胞内蛋白质和DNA相互作用情况。最好使用新鲜的甲醛,注意甲醛是否已经过了有效期。刚开始进行染色质免疫沉淀实验时,甲醛固定的时间要进行优化。甲醛固定的时间太长,虽然会得到更多的蛋白质和DNA交联复合物,但是需要更多时间进行超声打碎,使得样品溶液过热导致蛋白质和DNA变性。另外,过度固定交联,会使目的蛋内的抗原决定簇被屏蔽,不能和抗体结合有效结合,而引起免疫沉淀下降。甲醛固定的时间如果太短的话,蛋白质和DNA形成的复合物交联不牢固,很容易在超声时分离,可能在离心步骤时引起丢失。因此要对甲醛的固定时间进行优化,一般的时间为10~20 min。

2.2超声打碎染色质样本所获得的DNA片段大小

  用于染色质免疫沉淀实验的最佳DNA片段要求在超声后为200 ~1000 bp。获得恰当大小的DNA片段关系到实验的成败以及对实验结果的解释。因此要重视超声条件的优化实验。根据不同细胞类型和细胞浓度,选择不同的超声时间和超声次数。超声时要把超声针头插入到接近离心管底部的地方,一般离底部5~10 mm,且不要碰到管壁。样本要放在冰上进行操作,以免超声时样品过热而使蛋白和DNA变性。超声时如果有气泡产生, 可进行短暂离心后再继续超声。超声优化实验过程中可每超声2次,就取10 μL超声染色质溶液,选取多次样本后,在1%~2%琼脂糖凝胶电泳,根据超声后的DNA片段大小以确定最佳超声条件。

2.3抗体能否识别和免疫沉淀目的蛋白的有效性

  目的蛋白抗体有效性也是染色质免疫沉淀实验的关键因素。要选择高质量,高亲和力和高效价的抗体来进行实验。先做Western Blot来检验在染色质免疫沉淀实验条件下抗体是否能够和目的蛋白的抗原决定簇结合而免疫沉淀。当抗体不能有效识别交联中的目的蛋白时,可更换其他不同靶向抗原决定簇的抗体或者降低甲醛固定交联时间。