抗体标记物的选择

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抗体标记

  抗体标记技术无论使用直接法还是间接法,最关键的是标记物的选用。下表列出常用的标记物及其优缺点和使用情况。对某些技术而言,选用标记物是非常明确的。例如,荧光标记物主要用于细胞分选或高分辨免疫染色,常规免疫组织学最常用酶标抗体。随着化学发光法的广泛应用,免疫印迹亦可选用酶标试剂。对于其他技术来讲,标记物的选择较为次要。如酶标和碘标抗体均可用于免疫分析。酶标记物的应用范畴非常广泛, 其优点是结果即时可见、敏感性高,但较难应用于定量分析,这是由于需要测定酶反应效率以得到结合状态的酶的准确量值,而且酶标试剂不是均质性的。荧光标记是一种非常好的在亚细胞水平精确定位的方法。碘标记物,尤其是直接碘标记的单抗.在免疫分析中能给出非常稱确的定量结果。

标记物 应用范围 直接法或间接法 检测方法 优点 缺点
荧光色素 免疫染色 直接法或间接法 荧光显微镜检 保存时间长分辨力好 自发荧光
生物素 免疫染色/免疫分析/免疫印迹 直接法或间接法 与各种标记物偶联的亲和素或链霉亲和素 保存时间长
敏感性高
通用检测手段
多种检测方法
多步骤,内源性生物素干扰
免疫染色/免疫印迹 间接法 色原底物显色 保存时间长
敏感性高
肉眼可见结果
多步骤,内源性酶干扰低分辨力
免疫分析 直接法或间接法 γ-计数仪
X光胶片
易定量
敏感性高
半寿期短,对健康的潜在性危害
生物合成 免疫分析/免疫印迹 直接法 β-计数仪
X光胶片
不损伤抗体,容易操作 需要杂交瘤,敏感性低,半寿期短

1.生物素标记

  用生物素标记一抗是一种尚待完善、可以解决许多标记困难的方法。生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性,生物索标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂为亲和素和链霉亲和素,所需的各种标记物均可购置。此外,亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低,结合紧密而快速,故可消除多步骤程序中的许多缺点。生物素标记的主要优点是标记一抗后,再选用亲和素或链霉亲和素标记的二级试剂进行测定。

2.荧光色素标记抗体

  荧光色素是最常用于标记抗体的标记物之一。荧光素经恰当的激发可发光,从而得知抗体的定位和待测抗原的分布情况。最常用的方法是间接法,即标记针对一抗的特异性二抗。间接法中所用的以各种荧光素标记的相应二抗或其他试剂均可购得。然而有时需要直接标记一抗。当需要同时显示同种属同类或亚类的两种抗体时,最好是选用直接标记纯化抗体的方法,这样便可比较相同细狍、组织或标本中两种抗原的分布。

  常用的4种荧光色素是荧光素、罗丹明、Texas红和藻红蛋白。

3.放射性碘标记抗体

  抗体或其他蛋白与放射性碘结合是一种直接有效的标记方法。用γ计数仪或胶片曝光很容易检测放射活性碘。尽管某些形式的碘容易挥发,在处理此类放射性核素时须小心操作,但是只要处理得当,碘化抗体并不会带来任何过度的危害。而且,由于容易检测和精确定量使其在某些情况下成为一种较理想的方法。主要用于免疫分析,也适合应用于碘化标记检测法。

4.生物合成法标记单克隆抗体

  如果采用上述常规方法标记单克隆抗体,可使其活性降低。一种简捷的标记方法是使杂交瘤细胞在含有放射性氨基酸的环境中生长.当其合成免疫球蛋白时主动摄取的放射性原料搀入多肽链内进行标记。这种方法虽然只能用来标记由杂交瘤细胞合成的抗体,但所得抗体具有许多潜在的重要特性,最突出的是标记的抗体与未标记的抗体基本上相同。因此,这些放射性物质标记的抗体对于许多需要标记免疫球蛋白的技术来说是非常有用的。

  在这种方法中任何一种氨基酸都可用来标记抗体,然而最常用的首选含35S的氨基酸,35S的半寿期(87天)较长,可以存放较久。35S分子衰变所释放的能量较高,比较容易检测。