单克隆抗体亲和力测定

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单克隆抗体亲和力(affinity of antibodies)测定

  抗体亲和力是指抗体的抗原结合位点与对应的抗原决定簇之间的结合强度,是抗原与抗体之间固有的结合力,代表了两者之间特异结合的紧密程度。

  抗体的亲和力的大小对单克隆抗体的使用具有一定指导意义,例如用在疾病检测及治疗方面,选用高亲和力的单克隆抗体,而用于亲和层析,则应该选择亲和力较弱的单克隆抗体。因此测定亲和力是检测单克隆抗体效能的重要指标。

测定单克隆抗体亲和力的方法有哪些?

平衡透析法

  该方法适用于测定小分子半抗原抗体的亲和力。将单克隆抗体与半抗原分别置于半透膜两侧,半抗原能透过半透膜,进而与单克隆抗体结合,当反应达到平衡时,分别测定游离半抗原和结合半抗原的浓度,通过方程式便可计算亲和力常数,该亲和力常数代表单克隆抗体的亲和力。

方程式:1/[b]=1/K*1/[Ab]*1/[H]+1/[Ab]
[b]=与抗体结合的半抗原的质量摩尔浓度
[H]=游离半抗原的质量摩尔浓度
[Ab]=抗体质量摩尔浓度*抗体结合价,即为抗体结合价浓度
K即为抗体亲和力常数

  该方法即利用小分子能穿透半透膜的原理,所以也可用于测定小分子抗体和相应分子量较大的抗原之间的亲和力,如Fab抗体与病毒颗粒之间的亲和力。

结合抗原沉淀法

  将一定量的单克隆抗体与抗原一同孵育,当反应达到平衡时,在反应体系中加入50%饱和硫酸铵或者15%聚乙二醇,抗体蛋白的溶解性变小而沉淀析出,进而将游离抗原与结合抗原分开,再通过平衡透析法中的方程式计算抗体亲和力常数。

同位素标记抗原测定法

  该方法是非常经典的亲和力常数测定方法。将抗原同位素标记后,系列稀释,与等量的单克隆抗体反应,反应达到平衡后,去除游离的抗原,测定各反应体系中抗体结合抗原的量,绘制结合曲线,根据米-曼氏动力学原理,以50%最大结合处抗体结合价浓度的倒数为亲和力常数。

酶联免疫吸附法(ELISA)

  抗体的亲和力不同即抗体与特异性抗原的结合力度不同,当在体系中加入能降低抗体亲和力的物质时,低亲和力抗体会被洗脱,高亲和力的抗体基本不受影响,ELISA检测法便是通过这个原理能建立的抗体亲和力测定方法。
ELISA检测抗体亲和力的经典方法:(1)在包被固相抗原的酶标板中加入变性剂;(2)向酶标板中加入抗体,做平行重复,反应完成后,分别用普通缓冲液和添加变性剂的缓冲液洗涤;(3)加入酶标二抗反应后,洗脱多余酶标二抗;(4)加入显色剂后终止反应,测定两种处理的吸光值。计算亲和力指数(Avidity Index,AI),AI=经尿素处理样本OD值/未经尿素处理样本OD值*100%。
具体检测抗体亲和力方法可参见ELISA测定抗体亲和力。

相对亲和力测定

  测定单克隆抗体对特定抗原的相对亲和力操作简便,可以对多种单克隆抗体与抗原的亲和力做出比较。相对亲和力测定对抗体的使用选择有一定的指导意义。
  该方法可固定一定量的抗原,将各单克隆抗体样品调节至相同浓度,分别与抗原反应,绘制反应曲线,反应越早达到平衡,该单克隆抗体的相对亲和力越高。

抗体亲和力测定的应用

  在机体的体液免疫中,再次应答所产生抗体的亲和力高于初次免疫应答产生抗体的亲和力,初期抗体与抗原结合力较弱,即为低亲和力抗体,随着机体与抗原的接触时间的推移,抗体逐渐成熟,其亲和力增加,即为抗体亲和力成熟。  测定抗体亲和力可以有效鉴别传染病毒是否为原发感染,对于治疗疾病有重要的指导意义,有利于产前诊断和优生优育,具有很好的临床价值。