过氧化物酶(HRP)偶联抗体流程

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材料

  50%(V/V)乙醇
  10 mmol/L NaHCO3
  1 mmol/L EDTA
  0.1 mol/L磷酸钠缓冲液,pH 6.8
  叠氮钠
  1 mg/ml抗体溶液
  辣根过氧化酶(HRP; Sigma TypeVI)
  0.1 mol/L碳酸盐缓冲液,pH 9.2
  1.71 mg/ ml NaIO4新配制
  葡聚糖凝胶G-25,中等凝胶介质
  5 mg/ml NaBH4于0.1 mmol/L NaOH新配制
  饱和硫酸铵 (SAS)溶液
  TEN缓冲液,pH 7.2
  牛血清清蛋白(BSA)
  甘油
  透析膜
  玻璃棉

步骤

  1)透析膜依次浸泡于50%乙醇1h,10 mmol/L NaHCO3 1h, 1 mmol/L EDTA 1 h,在蒸馏水中洗两次并放于含0.01% (m/V)叠氮钠的0. 1 mol/L磷酸钠缓冲液,于4℃保存。

  2)≥1 mg/ml抗体溶液(A280=1. 44 mg IgG/ml)对2L 0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钠缓冲液透析,于4℃缓慢搅动下过夜。

  3)10mgHRP溶解于1ml0.1mol/LpH9.2的碳酸盐缓冲液,取0.25ml加入0.25ml新配制的1.71 mg/ml NaIO4溶液中,盖紧混匀,于室温下避光放置2h。

  4)取1ml透析后的抗体溶液和0.25g SephadexG-25加至0.5mlHRP/NaIO4混合液中。用玻璃棉塞紧巴斯德吸管管尖并用Parafilm封口膜封好。将抗体/葡聚糖凝胶/HRP混合物加人巴斯德吸管,室温下避光放置3h。

  5)柱子用0.75ml碳酸盐缓冲液洗脱偶联物。加38μl5mg/mlNaBH4溶液至洗脱物中,室温下避光孵育30min。再加112μl 5mg/ml NaBH4溶液继续孵育60min。

  6)加0.9ml饱和硫酸铵溶液,于4℃下温和搅拌30min。于4℃,10000g离心15min。

  7)弃上清。沉淀重溶于0.75 ml TEN缓冲液中,装人透析袋于4℃对2 L TEN缓冲液透析过夜。更换TEN缓冲液再继续透析4h。

  8)从透析袋中取出偶联物,加BSA至20mg/ml。加等体积甘油,于-20℃保存。