过氧化物酶(HRP)偶联抗体流程

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将一些既易测定又具有高度敏感性的物质如HRP,FITC,Biotin等标记到特异性抗体分子上,可以通过这些标记物的增强放大效应来显示或定量反应系统中抗原或抗体的性质与含量。本文介绍了过氧化物酶(HRP)标记抗体的实验流程。

材料

试剂和耗材
50%(V/V)乙醇 10 mmol/L NaHCO3
1 mmol/L EDTA 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液,pH 6.8
叠氮钠 1 mg/ml抗体溶液
辣根过氧化酶(HRP; Sigma TypeVI) 0.1 mol/L碳酸盐缓冲液,pH 9.2
0.1 mol/L碳酸盐缓冲液,pH 9.2 1.71 mg/ ml NaIO4新配制
葡聚糖凝胶G-25,中等凝胶介质 5 mg/ml NaBH4于0.1 mmol/L NaOH新配制
饱和硫酸铵 (SAS)溶液 TEN缓冲液,pH 7.2
牛血清清蛋白(BSA) 甘油
透析膜 玻璃棉

HRP标记抗体步骤

  1)透析膜依次浸泡于50%乙醇1h,10 mmol/L NaHCO3 1h, 1 mmol/L EDTA 1 h,在蒸馏水中洗两次并放于含0.01% (m/V)叠氮钠的0. 1 mol/L磷酸钠缓冲液,于4℃保存。

  2)≥1 mg/ml抗体溶液(A280=1. 44 mg IgG/ml)对2L 0.1 mol/L pH 6.8的磷酸钠缓冲液透析,于4℃缓慢搅动下过夜。

  3)10mgHRP溶解于1ml0.1mol/LpH9.2的碳酸盐缓冲液,取0.25ml加入0.25ml新配制的1.71 mg/ml NaIO4溶液中,盖紧混匀,于室温下避光放置2h。

  4)取1ml透析后的抗体溶液和0.25g SephadexG-25加至0.5mlHRP/NaIO4混合液中。用玻璃棉塞紧巴斯德吸管管尖并用Parafilm封口膜封好。将抗体/葡聚糖凝胶/HRP混合物加人巴斯德吸管,室温下避光放置3h。

  5)柱子用0.75ml碳酸盐缓冲液洗脱偶联物。加38μl5mg/mlNaBH4溶液至洗脱物中,室温下避光孵育30min。再加112μl 5mg/ml NaBH4溶液继续孵育60min。

  6)加0.9ml饱和硫酸铵溶液,于4℃下温和搅拌30min。于4℃,10000g离心15min。

  7)弃上清。沉淀重溶于0.75 ml TEN缓冲液中,装人透析袋于4℃对2 L TEN缓冲液透析过夜。更换TEN缓冲液再继续透析4h。

  8)从透析袋中取出偶联物,加BSA至20mg/ml。加等体积甘油,于-20℃保存。

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