染色质免疫共沉淀(ChIP)下游检测方法总结

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>免疫检测技术服务>>染色质免疫共沉淀(ChIP)服务>>染色质免疫共沉淀下游检测方法

应用于染色质免疫共沉淀(ChIP)的下游检测方法 在线QQ技术支持

除了做验证实验外,ChIP DNA也可进行测序分析和芯片分析,测序分析对应的方法是染色质免疫共沉淀(ChIP-SEQ);芯片分析对应的方法是ChIP-on-chip。 这两种方法都可以用于分析目的蛋白结合的未知序列。

1、实时定量 PCR

用比较精确的实时定量PCR方法检测沉淀的DNA样品,称为实时定量染色质免疫共沉淀技术(qChIP)。这种方法是在体内确定DNA和蛋白质相互作用。与ChIP-on-Chip方法相比,成本低廉。目前实时定量染色质免疫共沉淀技术(qChIP)已经开始应用于分析减数分裂时期蛋白质和DNA相互作用的研究。

2、染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ )

为了在基因组范围内重新发现转录因子的结合位点,需进一步确定染色质免疫共沉淀实验得到的DNA样品的序列。 其序列可以通过直接测序确定,这种方法称为染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ)。ChIP-SEQ 为巨大的DNA并行序列应用快速进化平台,以高分辨率确定样品中富集的基因组区域。 目前,Illumina Genome Analyzer(GA)技术频繁用于染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ )应用的平台。其它针对高通量测序的平台是 Helicos HeliScope 和 ABI SOL- iD。


染色质免疫共沉淀

3、ChIP-on-chip

ChIP-on-chip是将染色质免疫共沉淀(ChIP)和DNA微阵列芯片技术相结合用来高通量分析DNA和蛋白质结合或者翻译后染色质/组蛋白修饰的一种方法。 该技术已经成为深入研究内源蛋白和DNA相互作用的有力工具。因该技术能在基因组范围内确定转录因子或组蛋白修饰所在位置的染色质结合位点,故也被称为全基因组定位分析 (genome-wide location analysis,GWLS)。

该技术是将染色质免疫共沉淀与包含整个基因组或特定目的区域的芯片联合使用,大规模地迅速确定生理条件下特定转录因子在染色体上的结合位点。具体方法是:将经过染色质免疫共沉淀的DNA样品纯化后进行PCR扩增, 然后用荧光素标记(如 Cy3)。对没有经过免疫沉淀反应富集的 Input DNA 样品也进行扩增,并且用另一种荧光素标记(如 Cy5),作为结合背景的参照。之后将这两种 DNA 杂交于包括基因组序列的微阵列芯片上,转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。样品准备是影响ChIP-on- chip 结果的一个重要因素。目前常用的是覆瓦式芯片(tiling arrays),该芯片包含完全非重复性基因组。由于ChIP-on-chip 实验数据量大,问题复杂,所以下游的生物信息学分析相当重要 。 Toedling 等人应用免费和公开的资源 R package Ringo,使 ChIP-on-chip 实验数据的分析更便利。这个软件能提供循环数据输入功能,质量评价,标准化和形象化数据,检测ChIP富集的基因组区域。

ChIP -on -chip 扩展了染色质免疫共沉淀(ChIP)技术的应用范围,可以用于基因组功能的研究,能够绘制基因顺式调控区域和核小体位置及修饰的细节,完善 真核生物的序列。这种方法首次应用在酿酒酵母的研究上,之后被应用于人细胞的研究。在医学方面,已经应用“ChIP-on-chip” 技术确定了骨细胞的动态转录机制。总之,ChIP-on-chip已经成为一种在基因组范围内研究蛋白质和DNA相互作用及转录调控机制的常用方法。 随着各个物种基因组覆瓦式芯片陆续发布,全基因组定位分析技术的应用将会越来越广泛。

 

染色质免疫共沉淀

 

4、染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ)和ChIP-on-chip技术的比较

染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ)和 ChIP-on-chip 是两类在基因组范围内产生DNA结合图谱的基本方法。 ChIP- SEQ 和 ChIP-on-chip的主要区别是分辨率、覆盖范围和灵敏度(表 1)。从理论上来讲,测序技术需要单核苷酸分辨率,而芯片技术受到覆瓦(tiling)度的限制。已经有将染色质免疫共沉淀技术和 测序结合(ChIP-SEQ)或者与全基因组阵列分析结合(ChIP-on-chip),产生特定蛋白质的基因组结合图谱的研究。如果将以上两种方法结合,ChIP-on-chip 可作为在基因组范围内评价转录因子结合位点的第 1 步,来粗略估计结合位点的数目和富集的总体值;然后通过染色质免疫共沉淀测序(ChIP-SEQ),以更好的分辩率深入描述结合位点。目前,已经用 ChIP-SEQ 和 ChIP-on-chip 确定了拟南芥花调控因子 SEPALLATA3 (SEP3)的结合位点,