免疫组化染色实验步骤与注意事项

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     本文介绍了免疫组化染色的具体实验步骤与实验注意事项,主要有4大步骤,分别是石蜡切片免疫组化染色实验步骤、细胞爬片的免疫组化染色、冰冻切片的免疫组化染色、切片的预处理。

免疫组化染色

一.石蜡切片免疫组化染色实验步骤:

1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置60℃1小时)。
(1)二甲苯I、II,各10分钟。
(2)梯度酒精:100%,2分钟95%,2分钟80%,2分钟70%2分钟。
(3)蒸馏水洗:5分钟,2次(置于摇床)。
2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温10分钟(避光)。
3.蒸馏水洗:5分钟,2次(置于摇床)。

4.抗原修复:根据待检测的抗原,选择适当的方法。

附:抗原修复液(10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制
(1)储备液的配制:
A 液:枸橼酸三钠-2H2O29.41g+蒸馏水1000ml
B 液:枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
(2)工作液的配制:A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml
抗原修复的方法:
(1)高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲,以助冷却)。
(2)微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液;再选择中高或高档,5分钟(最佳温度为92-95℃)
(3)酶消化处理:此略。

抗原修复的注意事项:

(1)组织不能干。
(2)选择抗原修复方法要因抗体而异。
(3)该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
(4)抗原修复后至DAB显色的过程中,均需用PBS缓冲液。
5.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。
6.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态),滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理,37℃,15分钟。
附:正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)
按 1:20 比例,用PBS配制,每张切片需要量按50ul+5ul(10%抛洒量)计算 。
7.滴加第一抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37℃2小时(也可置于4℃冰箱过夜)。
8.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。
9.滴加生物素化的二抗,37℃,40分钟。
10.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。
11.滴加三抗 (SAB复合物)37℃,40分钟。
12.PBS:5分钟,2次(置于摇床)。
13.DAB显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止)。
附:DAB 的配制

(1)储备液(DAB25mg/ml)的配制:DAB250mg+PBS 10ml,待完全溶解后分装成1ml,100ul,50ul,20ul等,—20℃,冻存。
(2)工作液:DAB储备液 20ul+PBS1000ul+3%H2O25ul
14.自来水(细水)充分冲洗。
15.苏木素复染,室温,30秒,自来水冲洗。
16.自来水冲洗返蓝,15分钟。
17.梯度酒精脱水:80%,2分钟95%,2分钟100%,2次,5分钟。
18.二甲苯透明:I,II(二甲苯)各5分钟
19.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。

二.细胞爬片的免疫组化染色:

1. 取出细胞爬片,迅速置入冷丙酮固定20-30分钟。
2. 蒸馏水浸泡5分钟,2次。
3. 打孔液浸泡5分钟。
4. 蒸馏水浸泡5分钟,2次。
5. 后接前述实验步骤的第6步(正常血清封闭)。
注:第3、4步仅用于检测细胞内抗原,检测细胞膜抗原时不用。

三.冰冻切片的免疫组化染色:

1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为 5~6um。
2. 载玻片可不打底,裱片后,立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色,可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton 打孔)
6. 3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;
7. 用PBS洗2次,每次5分钟;
8. 接前面实验步骤第六步。

四.切片的预处理:

1. 洗衣粉液浸泡 30 分钟,冲洗,晾干。
2. 洗液(含强酸、高锰酸钾等)浸泡24小时,冲洗,晾干。
3. APES(1:50 丙酮溶液)10-20 秒(注意:不能用塑料容器及塑料切片架)。
4. 纯丙酮I,约10秒。纯丙酮II,约5秒
5. 晾干或烤箱内烤干,备用。

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