本文介绍了免疫组化染色的具体实验步骤与实验注意事项，主要有4大步骤，分别是石蜡切片免疫组化染色实验步骤、细胞爬片的免疫组化染色、冰冻切片的免疫组化染色、切片的预处理。

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
（1）二甲苯I、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟95%，2分钟80%，2分钟70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H₂O₂，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制
（1）储备液的配制：
A 液：枸橼酸三钠-2H2O29.41g+蒸馏水1000ml
B 液：枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
（2）工作液的配制：A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml
抗原修复的方法：
（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟（最佳温度为92-95℃）
（3）酶消化处理：此略。

抗原修复的注意事项：

（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5.PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)
按 1:20 比例,用PBS配制,每张切片需要量按50ul+5ul(10%抛洒量)计算 。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
8．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。
10．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
11．滴加三抗 （SAB复合物）37℃，40分钟。
12．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
13．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：DAB 的配制

（1）储备液(DAB25mg/ml)的配制：DAB250mg+PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，冻存。
（2）工作液：DAB储备液 20ul+PBS1000ul+3%H2O25ul
14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15分钟。
17．梯度酒精脱水：80%，2分钟95%，2分钟100%，2次，5分钟。
18．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5分钟
19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

二．细胞爬片的免疫组化染色：

1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20-30分钟。
2. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
3. 打孔液浸泡5分钟。
4. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
5. 后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。
注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

三．冰冻切片的免疫组化染色：

1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为 5～6um。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton 打孔)
6. 3%H₂O₂灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;
7. 用PBS洗2次,每次5分钟;
8. 接前面实验步骤第六步。

四．切片的预处理：

1. 洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干。
2. 洗液（含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。
3. APES（1:50 丙酮溶液）10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。
4. 纯丙酮I，约10秒。纯丙酮II，约5秒
5. 晾干或烤箱内烤干，备用。

以上就是我们关于免疫组化染色具体实验步骤与实验注意事项的介绍，更多关于免疫组化的信息请联系我们。

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