ELISA实验设计思路、基本步骤以及注意事项

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ELISA实验设计思路、基本步骤以及注意事项

  不管是哪一种ELISA,它的操作都由以下几种基本的操作组合而成:①将抗原或抗体吸附到固相载体上;②加入待检样品以及后续试剂;③温育;④洗涤去掉游离未结合的反应物;⑤加入酶检测底物;⑥结果的判读。

  下面将列举几种常用的ELISA实验方法。

1.材料、仪器及试剂

(一)试剂

包被缓冲液(pH9.6, 0.05mol/L碳酸盐缓冲液):
Na2CO3 1.59g; 加蒸馏水至1000mL。  
NaHCO3 2.93g;    
洗涤缓冲液(PH7.4, 0.15mol/L PBS):  
KH2PO4 0.2g; KCI 0.2g;
Na2HPO4•12H2O 2.9g; Tween-20 0.05%0.5mL;
NaCl 8.0g; 加蒸馏水至1000mL。  
稀释液:
牛血清白蛋白(BSA) 0.1g; 加洗涤缓冲液至 100mL
终止液(2mol/L H2SO4):
蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%) 21.7mL。
底物缓冲液(pH5.0磷酸柠檬酸):
0.2mol/L ; Na2HPO4(28.4g/L) 25.7mL  
0.1mol/L. 柠檬酸(19.2g/L) 24.3mL;  
加蒸馏水50mL。
TMB (四甲基联苯胺)使用液:
TMB (10mg/5mL无水乙醇) 0.5mL; 0.75%H2O2 32μIre
底物缓冲液(pH5.5) 10mL;    
ABTS使用液:
ABTS 0.5mg; 3% H2O2 2uL.
底物缓冲液(pH5.5) 1mL;    
抗原、抗体和酶标记抗体。
正常人血清和阳性对照血清。

(2)器材

  聚苯乙烯塑料板(简称酶标板) 40孔或96孔,ELISA检测仪,4℃冰箱,37℃孵育箱等。

2.实验步骤

步骤|方法 间接法(测抗体) 双抗体夹心法
(测抗原)
竞争法(测抗原) 竞争抑制性测定法
(测抗原)
1 包被抗原:用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度,0.1mL加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或 37℃水浴2~3h 包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1-10μg/mL),每凹孔加0.1ml, 4℃过夜,或37℃水浴3h
包被特异性抗体:同左 包被抗原:同左
2 洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液洗3次,每次5min
同左 同左 同左
3 加被检标本:每凹孔加人一定稀释的被检血清0.1mL,37℃,作用1-2h 每凹孔加人0.1mL用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本,37℃作用1-2h
分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.1ml,另一组只加酶标记抗原液0. lmL,37℃作用1-2h(混合液可作成不同稀释度)
分2组,a组加参考抗体和被检抗原混合液0.1mL,另一组加参考抗体与等量稀释剂0. 1mL,37℃作用1-2h
4 洗涤:重复2 洗涤:重复2 洗涤:重复2 洗涤:重复2
5 加入酶结合物:每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.1mL,37℃作用1-2h 加入0.1nL用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37℃作用1-2h或由预试实验确定作用时间
  各加人0.1mL抗参考抗体的酶标抗体,37℃作用1-2h
6 洗涤:重复2 洗涤:重复2   洗涤:重复2
7 加入0.1mLTMB底物溶液,温室作用30min 同左 同左 同左
8 终止反应:每凹孔加2mol/L H2SO40.05mL 同左 同左 同左
9 观察记录结果:目测或用酶标比色计450nm测定OD值 同左 用酶标比色计450nm测定a.b两组OD值,并求出abOD值的差数
同左

3.注意事项

  (1)正式实验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件,待检样品应做一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
  (2) 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括以下几点。
①固相载体的选择。许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一,据此判明其吸附性能是否良好。
②包被抗体(或抗原)的选择。将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时-般要求pH在9.0-9.6之间。吸附温度、时间及其蛋白量也有一定的影响,一般多采用4℃18-24h。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.lμg/mL、1.0μg/mL和10μg/mL等)进行包被后,在其他实验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说,通常为1-10μg/ mL。
③酶标记抗体工作浓度的选择。首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部分)。然后再固定其他条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
④酶的底物及供氢体的选择。对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显的显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护,有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间以10-30min为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。